Producción de una preparación de vacuna homogénea para el tratamiento del cáncer.

La presente invención se relaciona con la rama de la biotecnología y mas específicamente con la salud humana.

Particularmente, lapresente invención describe una composición vacunal para su uso terapéutico en pacientes de cáncer. La composición vacunal descrita en la presente invención tiene como principio activo un conjugado químico entre el Factor de Crecimiento Epidérmico humano recombinante (hrEGF) y la proteína recombinante P64k. Además, se describen condiciones específicas para la realización de una reacciónde conjugación que permiten obtener de manera controlada y reproducible dicho conjugado químico. En otro aspecto la presente invención se relaciona con un procedimiento para la purificación del conjugado químico que no solo le aporto mayor pureza a la composición vacunal terapéutica, sino que sorprendentemente incremento laactividad inmunogénica, provocando incrementos significativos enlos títulos de anticuerpos anti EGF en humanos. Adicionalmente la presente invención proporciona la metodología para lograr un preparado vacunal con más de un tipo de presentación de dosis (miligramos totales de conjugados EGF-P64k/vial). Esta versatilidad enla presentación del preparado vacunal permite incrementar la dosis de inmunización por paciente, sin que esto conlleve a aumentarla frecuencia de inmunización y/o el número de sitios de inmunización. Por ultimo, la presente invención involucra un procedimiento sanitario para la obtención del preparado vacunal para la terapia del cáncer, administrado por vía parenteral.

Producción de una preparación de vacuna homogenea para el tratamiento del cancer Campo tecnico La presente invención se refiere a la biotecnologia, en particular relacionada con la salud humana. En una realización, la presente invención describe vacunas del cancer protectoras y/o terapeuticas, principalmente composición de vacunas para provocar un aumento significativo de la respuesta inmunológica contra el factor del crecimiento epidermico (EGF) , cuya importancia oncológica se ha demostrado con amplitud, principalmente para el crecimiento de tumores de origen epitelial.

Tecnica anterior El sistema del receptor de EGF (EGFR) , incluyendo los ligandos, es un complejo molecular que regula de modo especifico el crecimiento celular y sus efectos sobre el crecimiento incontrolado de tumores epiteliales.

En el proceso tumorigenico, la desregulación de procesos paracrinos y autocrinos para la activación del EGRF implica la sobreexpresión de los factores del crecimiento, asi como una mayor sintesis y/o mutación de los receptores.

El EGF es un polipeptido de 53 aminoacidos con un peso molecular aparente de 6045 Da. Este peptido fue aislado y purificado por primera vez por Cohen S., J. Biol. Chem., 20 (1962) , 237, 1.555.

El EGF es un miembro de la familia de ligandos del EGFR; esta familia comprende proteinas relacionadas desde el punto de vista estructural y funcional. Otros miembros de la familia son el factor del crecimiento transformante (TGF) , la anfirregulina (AR) , el criptol (CR1) , el factor del crecimiento de unión a heparina, la betacelulina y la efirregulina. Por otra parte, la familia de los poxvirus incluye proteinas relacionadas con el EGF; entre estas, la mas caracterizada es el factor del crecimiento del virus de vaccinia (VGF) .

Todas estas moleculas son capaces de unirse a EGFR con la consiguiente activación del receptor, de modo que se conocen como ligandos de EGFR y desemperan un papel en el crecimiento de celulas normales y tumorales.

El EGFR es una glicoproteina de 170 kDa; el gen ya ha sido clonado y secuenciado. El dominio intracelular de este receptor esta asociado con la actividad tirosina quinasa de moleculas que muestran una homologia estructural con las proteinas codificadas por el oncogen v-erb-B, y estan implicadas en los proceos de transformación malignos (Heldin, C.H. (1984) , Cell, 37, 9-20) .

Las pruebas experimentales de los ultimos aros acerca de la relación entre el EGFR y su sistema de ligandos con el cancer hacen que sea una diana muy atractiva para la inmunoterapia del cancer.

Resultados previos han demostrado la eficacia en el cancer de la inmunoterapia activa con una vacuna basada en EGF. De hecho, se han obtenido pruebas preclinicas y clinicas sobre la inmunogenicidad y la carencia de toxicidad producida por la vacunación con el hrEGF unido a una proteina portadora (Gonzalez et al. (1996) , Vaccine Research, 5 (4) , 233-243) .

El documento EP 0657175 describe una composición de vacuna que comprende EGF aut6logo acoplado con una proteina portadora que inhibe el crecimiento de tumores dependientes de EGF a traves de un efecto autoinmunológico.

La composición de vacuna descrita en el documento EP 0657175 consiste en vacunas conjugadas que comprenden el EGF acoplado a una proteina portadora (la proteina P64K, la cadena B de la toxina del c6lera, la proteina del toxoide tetanico y/o anticuerpos monoclonales) y, como consecuencia, se obtiene una mezcla heterogenea y poco reproducible de especies conjugadas. La nueva composición de vacuna descrita en la presente invención comprende el EGF aut6logo como principio activo, y se caracteriza porque tiene una composición quimica homogenea con una pureza definida, que provoca una mayor inmunogenicidad, una actividad clinica sustancialmente mayor y con menores inmunizaciones para obtener un efecto terapeutico.

El menor contenido en antigenos aut6logos en la composición de vacuna de la presente invención sorprendentemente no induce unos menores titulos de anticuerpos EGF en seres humano; al contrario, mas bien induce un aumento significativo de los titulos de anticuerpos anti-EGF. La menor cantidad de contenidos de EGF y sus derivados en la composición de vacuna se obtuvo desarrollando un metodo de purificación basado en la filtración de membranas, que tambien es un objeto de la presente invención.

Ademas, la presente invención proporciona una composición de vacuna homogenea y reproducible con un mayor efecto clinico y menos inmunizaciones, lo cual significa una gran ventaja para la terapia del cancer y para el paciente, en comparación con las composiciones de vacunas previamente descritas.

La composición de vacuna de la presente invención tambien puede comprender adyuvantes apropiados, tales como hidróxido de aluminio o Montanide.

En otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento sanitario para la fabricación de dicha composición de vacuna, apropiado para su uso en seres humanos por la via parenteral.

El procedimiento comprende un metodo adecuado para la conjugación covalente del hrEGF con la proteina portadora P64K, y la purificación del conjugado utilizando membranas de ultrafiltración en el intervalo de 50-100 kDa, para eliminar las especies biológicamente inactivas conjugadas (sin actividad inmunogenica) , asi como otras impurezas quimicas.

Descripcion detallada de la invencion La presente invención describe una nueva composición de vacuna basada en el EGF aut6logo, teniendo dicha composición de vacuna una composición quimica homogenea con una pureza definida, que es capaz de provocar una mayor inmunogenicidad y una actividad clinica sustancialmente mayor. Cuando deba aumentarse la dosis terapeutica, con el procedimiento para obtener la composición de vacuna de la presente invención es posible aumentar la concentración de las especies conjugadas de hrEGF-rP64K (conocida como potencia) sin aumentar el numero de inyecciones.

De modo sorprendente, los inventores han descubierto que cuando se disminuye el contenido del antigeno aut6logo mediante un nuevo procedimiento de purificación, la composición de vacuna de la presente invención es capaz de provocar un aumento significativo de la respuesta inmunológica contra el EGF aut6logo, en comparación con las vacunas basadas en EGF heterogeneas previamente documentadas.

La composición de vacuna obtenida por la disminución en el contenido del antigeno aut6logo a traves de una metodologia de purificación por membranas de ultrafiltración tiene una composición homogenea, en la que la especie inmunológicamente activa (especie conjugada de hrEGF-rP64K) tiene un peso molecular mayor que 60 kDa. Esta composición de vacuna muestra un perfil cromatografico de exclusión molecular que se caracteriza porque la especie que presenta la actividad biológica representa mas del 90% del area total del cromatograma, que se corresponde con la composición de vacuna total, tal como se muestra en la figura 4.

Un analisis de espectrometria de masas de la presente composición de vacuna ha revelado sus caracteristicas estructurales. Los mapas peptidicos de dos lotes diferentes muestran una alta homologia entre los lotes en la posición s, asi como en la proporción (figura 5) . Esta alta homologia entre los lotes confirma la precisión de los parametros de la configuración quimica, asi como de los procedimientos de purificación, describiendose ambos en la presente invención. El analisis de espectrometria de masas tambien revela la secuencia de los peptidos principales derivados de la composición de vacuna de la presente invención (tabla 3) .

En la presente composición de vacuna, la proporción de conjugación entre las proteinas EGF y de P64K es de 1:2, lo cual significa 2 moleculas de EGF por molecula de P64K.

Metodologia para obtenera la composicion de vacuna Procedimiento de purificacion para disminuir el contenido en EGF autologo Comenzando a partir de observaciones experimentales que prueban que una disminución en el contenido en hrEGF en la composición de vacuna aumenta su acción inmunológica, se ha desarrollado un metodo para disminuir el contenido en hrEGF en la mezcla heterogenea de conjugados, enriqueciendo la composición de vacuna en especies conjugadas de alto peso molecular (especies inmunológicamente activas) y estando exenta de glutaraldehido.

El procedimiento de purificación que emplea membranas de ultrafiltración en un intervalo de aproximadamente... [Seguir leyendo]

1. Una composición de vacuna que comprende, como principio activo, el conjugado de proteinas hrEGF-rP64K, en la que cada molecula de proteina P64K esta unida a dos moleculas de hrEGF, y en la que la composición de vacuna comprende al menos 90% del principio activo.

2. La composición de vacuna segun la reivindicación 1, en la que la proporción de conjugación entre la proteina portadora rP64K y el hrEGF es de 12, 04:24, 05 nmolar.

3. La composición de vacuna segun la reivindicación 1, en la que dicha composición es una mezcla homogenea del conjugado de hrEGF-rP64K que esta exenta de otras especies moleculares, tales como polimeros de hrEGF o hrEGF libre.

4. La composición de vacuna segun la reivindicación 1, en la que la mezcla homogenea del conjugado de hrEGFrP64K esta exenta de glutaraldehido.

5. La composición de vacuna segun la reivindicación 2, en la que la mezcla homogenea del conjugado de hrEGFrP64K contiene ademas un adyuvante apropiado, seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de aluminio o Montanide.

6. La composición de vacuna segun la reivindicación 1, en la que la mezcla homogenea del conjugado de hrEGFrP64K es capaz de inducir un aumento en al menos 10 veces de los titulos de anticuerpos anti-EGF en el suero de animales inmunizados.

7. La composición de vacuna segun la reivindicación 1, en la que la mezcla homogenea del conjugado de hrEGFrP64K es capaz de inducir un aumento en al menos 10 veces de los titulos de anticuerpos anti-EGF en el suero de seres humanos.

8. La composición de vacuna segun la reivindicación 1, en la que la mezcla homogenea del conjugado de hrEGFrP64K es capaz de inducir un aumento en al menos 100 veces de los titulos de anticuerpos anti-EGF en el suero de seres humanos.

9. Un procedimiento para obtener la composición de vacuna de la reivindicación 1 bajo estandares sanitarios, en el que dicho procedimiento comprende condiciones apropiadas para la conjugación covalente del EGF a la proteina portadora rP64K, y la purificación del complejo molecular, mediante la utilización de una membrana de ultrafiltración, para eliminar las especies conjugadas biológicamente inactivas y otras impurezas quimicas.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la reacción de conjugación consiste en una unica etapa que comienza mezclando la proteina hrEGF previamente concentrada (> 6 mg/ml) y la proteina P64K (≥ 1 mg/ml) en el reactor de conjugación, y despues aradiendo a la mezcla una disolución de PBS/MgCl2 (pH 6, 8-7, 2) y la disolución de conjugación de glutaraldehido al 0, 5%, e incubando dicha mezcla a 22 DC ± 2 DC con agitación continua durante dos horas.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que los parametros de la conjugación entre las proteinas hrEGF y rP64K ajustan la proporción de conjugación a dos moleculas de hrEGF por cada molecula de rP64K.

12. El procedimiento para obtener la composición de vacuna segun la reivindicación 9, en el que la proteina conjugada se purifica mediante un metodo de ultrafiltración/diafiltración utilizando una membrana que tiene un tamaro de poro entre 50 y 100 kDa.

13. El procedimiento para obtener la composición de vacuna segun la reivindicación 12, en el que la proteina conjugada se purifica mediante un metodo de ultrafiltración/diafiltración utilizando una membrana que tiene un tamaro de poro de 50 kDa o 100 kDa.

14. La composición de vacuna segun la reivindicación 1 que comprende, como principio activo, el conjugado de proteinas hrEGF-rP64K, en la que dicha composición de vacuna se purifica mediante el procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-13.

15. La composición de vacuna segun la reivindicación 1 que comprende, como principio activo, el conjugado de proteinas hrEGF-rP64K, en la que la concentración final de las proteinas totales esta en el intervalo de 1-12 mg/ml.

16. La composición de vacuna segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9, 14 o 15, para su uso para el tratamiento de tumores epiteliales.