Un procedimiento para la producción de un biopolímero de interés en un proceso de fermentación en continuo por perfusión,

en el que el biorreactor comprende una unidad de filtrado de impurezas y un módulo de recogida de producto, caracterizado porque:

(i) la unidad de filtrado de impurezas permite eliminar impurezas con un PM inferior al PM del biopolímero de interés mientras se retienen células y el biopolímero de interés en el biorreactor (llamado "filtro de impurezas"); y

(ii) el módulo de recogida de producto permite eliminar el biopolímero de interés e impurezas mientras se retienen células en el biorreactor (llamado "módulo de recogida de impurezas");

en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:

(a) fermentar células que expresan el biopolímero de interés en el biorreactor en un medio adecuado en condiciones adecuadas;

(b) durante la fermentación se eliminan impurezas mediante el filtro de impurezas;

(c) durante la fermentación se recoge el biopolímero de interés mediante el módulo de recogida de producto;

(d) durante la fermentación se añade medio recién preparado para reponer nutrientes consumidos por las células y equilibrar el medio eliminado durante las etapas (b) y (c); y

(e) aislar el biopolímero de interés del medio de recogida; y

en el que la densidad celular en el biorreactor durante la fermentación alcanza al menos 10 millones de células por ml de medio; y

en el que se eliminan impurezas a través mediante impurezas por un caudal a través del filtro de impurezas de la etapa (b) que es al menos un 25 % del caudal a través del módulo de recogida de producto de la etapa (c).

un procedimiento para producir un biopolímero (por ejemplo un polipéptido) en un proceso de fermentación en continuo

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a un procedimiento para mejorar la productividad en fermentaciones microbianas y reactores biológicos de cultivo celular de mamíferos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Tradicionalmente, las células de mamíferos, así como las células bacterianas, se cultivan principalmente como cultivos en suspensión en reactores biológicos, que se llaman también fermentadores. Las condiciones del entorno pueden controlarse de manera precisa en tales recipientes. Un medio de agitación mueve el medio de cultivo en el interior del reactor y proporciona de esta manera una distribución homogénea de las células.

El suministro de nutrientes a las células y la eliminación de materiales de desecho tienen lugar, en el caso de cultivos líquidos en suspensión en reactores biológicos, de acuerdo con uno de los siguientes procedimientos:

En una operación por lote, el reactor funciona de forma discontinua. Al comienzo de un lote, el medio de cultivo normalmente contiene un medio con los nutrientes necesarios, por ejemplo glucosa, vitaminas, aminoácidos y minerales. Durante la fermentación, estos se consumen, de tal manera que el medio se vuelve cada vez más pobre en nutrientes. Al mismo tiempo, la concentración de productos de desecho aumenta, lo que finalmente da como resultado una detención del crecimiento celular. La densidad celular viable alcanza un valor máximo y después desciende de nuevo. En consecuencia, el cultivo se interrumpe normalmente cuando se alcanza la densidad celular máxima o se alcanza una viabilidad celular mínima. El contenido del reactor se pasa después para procesamiento corriente abajo adicional.

Un procedimiento por lote podría mejorarse renovando repetidamente el medio de cultivo sin eliminar por ello las células. Sin embargo, para este fin, debe añadirse un medio recién preparado al cultivo celular durante la fermentación o como alternativa una parte del medio de cultivo debe eliminarse repetidamente incluso aunque no se haya consumido en absoluto. Este procedimiento es caro porque especialmente el medio de cultivo de las células de mamífero es difícil de desarrollar y de producir y en consecuencia es caro. En este sentido, el llamado "procedimiento semi-continuo" (llamado como alternativa procedimiento de lote alimentado) es un procedimiento en el que, durante el procedimiento de fermentación, el medio de cultivo recién preparado no se suministra en su totalidad sino que sólo se suministran los nutrientes consumidos. Sin embargo, en la práctica este procedimiento no proporciona ninguna ventaja sustancial debido a un aumento de los materiales de desecho que conduce a un recorrido característico de la densidad celular durante el procedimiento de cultivo de manera similar a la del caso del procedimiento puramente en lote.

El tercer procedimiento es el procedimiento continuo. En este, las condiciones del entorno pueden ajustarse uniformemente de tal manera que las células puedan crecer de manera óptima. Sin embargo, el procedimiento es muy laborioso y caro porque el medio de cultivo debe suministrarse y eliminarse de forma continua (con células y producto) . Además, también en el caso de este procedimiento, no se ha alcanzado una densidad celular sustancialmente mayor que en el caso de los procedimientos mencionados anteriormente porque las células también se eliminan continuamente del reactor con la fuga del medio de cultivo celular.

Un ejemplo de un procedimiento continuo especial, es el llamado procedimiento de perfusión. En los procedimientos de cultivo por perfusión de la técnica anterior, los desechos o impurezas en el medio se eliminan continuamente del cultivo (se retienen las células más el producto en el biorreactor) y el medio desplazado se repone con medio recién preparado. La adición constante de medio recién preparado y la eliminación de productos de desecho proporciona a las células el entorno que requieren para conseguir concentraciones altas de células y con ello mayor productividad. De esta forma, es posible conseguir un estado de equilibrio en el que se mantengan la concentración celular y la productividad. El producto debe recogerse continuamente retirando medio (con células y producto) o mediante una así llamada purga.

En resumen, en un procedimiento continuo el biorreactor muchas veces no comprende un filtro que permita eliminar las impurezas mientras retiene las células y compuestos de alto peso molecular (por ejemplo, producto) en el biorreactor. En un procedimiento continuo de perfusión el biorreactor comprende un filtro para eliminar impurezas mientras retiene las células y el producto o un filtro que sólo retiene las células, es decir, tanto producto como impurezas pasan a través del filtro. Dicho en otras palabras, los reactores biológicos de la técnica anterior comprenden sólo un filtro.

El documento US 6544424 describe un sistema de filtración para fluidos biológicos creando un flujo tangencial alternativo (FTA) de fluido a través de un elemento de filtro en el que los fluidos de desecho pueden eliminarse del medio por filtración y puede añadirse fluido recién preparado para reponer el fluido filtrado. En el contexto actual esto puede verse como un ejemplo de un reactor con un filtro que permite eliminar impurezas mientras retiene células y compuestos de alto peso molecular (por ejemplo, producto) en el biorreactor.

En la figura 1 en la presente memoria, puede verse un reactor de la técnica anterior como un reactor con una sola unidad de filtrado UF para eliminar las impurezas o solo el filtro para eliminar producto e impurezas, es decir, un reactor que no comprende ambos filtros, mostrados en la figura 1. En otras palabras, el reactor descrito en, por ejemplo, el documento US 6544424 carece de la posibilidad de recoger productos biológicos de alto peso molecular de un filtro (filtro de producto) a una velocidad de efluente adecuada eliminando simultáneamente impurezas del recipiente de cultivo usando un segundo filtro (filtro de impurezas) a una velocidad de efluente adecuada.

Los siguientes documentos de la técnica anterior:

• Documento EP 270905A

• Stark et al., Advances in biochemical Engineering/ Biotechnology 2003 vol. 80, 149-175;

• Linardos et al., Biotechnology and Bioengineering 1992, vol. 39, 504-510

• Poertner et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 1998 vol. 50, 403-414

esencialmente describen reactores anteriores y sistemas de eliminación de impurezas como se ha abordado anteriormente y se ilustra en la figura 1, es decir, los reactores de la técnica anterior que carecen de la posibilidad de recoger productos biológicos de alto peso molecular de un filtro (filtro de producto) a una velocidad de efluente adecuada eliminando simultáneamente impurezas del recipiente de cultivo usando un segundo filtro (filtro de impurezas) a una velocidad de efluente adecuada.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

El problema a solucionar por la presente invención es proporcionar un procedimiento continuo (por ejemplo, un procedimiento de perfusión continuo) para aumentar la productividad de un biorreactor, en el que la productividad de un biopolímero (por ejemplo, un polipéptido) puede mejorarse debido a, por ejemplo, una densidad celular aumentada en el reactor y en particular una concentración significativamente mayor de biopolímero de interés en el medio recogido.

La solución se basa en que el presente inventor ha descubierto que teniendo una unidad de filtrado de impurezas con base de membrana (por ejemplo, ultrafiltración) y un módulo de recogida de producto diferente acoplado en un biorreactor puede aumentar la densidad celular en el reactor durante un procedimiento continuo y en particular puede conseguirse una concentración significativamente mayor de biopolímero de interés en el medio de recogida. El módulo de recogida de producto podría tener una unidad de filtrado con base de membrana (por ejemplo, ultrafiltración) . En tal caso el módulo de recogida de producto se denomina en la presente memoria filtro de producto.

Como se ilustra en la figura 1 en la presente memoria, la solución de la presente invención, que se refiere a un procedimiento para regular independientemente la eliminación de impurezas y recogida de productos es una solución en la que el biorreactor comprende una unidad de filtrado para permitir eliminar impurezas mientras retienen... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la producción de un biopolímero de interés en un proceso de fermentación en continuo por perfusión, en el que el biorreactor comprende una unidad de filtrado de impurezas y un módulo de recogida de producto, caracterizado porque:

(i) la unidad de filtrado de impurezas permite eliminar impurezas con un PM inferior al PM del biopolímero de interés mientras se retienen células y el biopolímero de interés en el biorreactor (llamado "filtro de impurezas") ; y

(ii) el módulo de recogida de producto permite eliminar el biopolímero de interés e impurezas mientras se retienen células en el biorreactor (llamado "módulo de recogida de impurezas") ;

en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:

(a) fermentar células que expresan el biopolímero de interés en el biorreactor en un medio adecuado en condiciones adecuadas;

(b) durante la fermentación se eliminan impurezas mediante el filtro de impurezas;

(c) durante la fermentación se recoge el biopolímero de interés mediante el módulo de recogida de producto;

(d) durante la fermentación se añade medio recién preparado para reponer nutrientes consumidos por las células y equilibrar el medio eliminado durante las etapas (b) y (c) ; y

(e) aislar el biopolímero de interés del medio de recogida; y

en el que la densidad celular en el biorreactor durante la fermentación alcanza al menos 10 millones de células por ml de medio; y en el que se eliminan impurezas a través mediante impurezas por un caudal a través del filtro de impurezas de la etapa (b) que es al menos un 25 % del caudal a través del módulo de recogida de producto de la etapa (c) .

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se eliminan impurezas mediante el filtro de impurezas por un caudal a través del filtro de impurezas de la etapa (b) de la reivindicación 1 que es al menos el doble del caudal a través del módulo de recogida de producto de la etapa (c) de la reivindicación 1.

3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el biopolímero de interés es un polipéptido de interés y en el que el módulo de recogida de producto es una unidad de filtrado (llamada "filtro de producto ") .

4. El procedimiento de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el biopolímero de interés es un polipéptido de interés y en el que el módulo de recogida de producto se basa en sedimentación centrífuga o gravitacional.

5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que:

- el polipéptido de interés tiene un PM de al menos 20.000 kDa; -el biorreactor tiene un volumen de al menos 50 L; -las dos unidades de filtrado diferentes (filtro de impurezas y producto) son filtros de membrana y se sitúan en dos aparatos de soporte de filtro separados físicamente; -el filtro de impurezas tiene tamaño de poro con un punto de corte nominal de peso molecular de membrana (NMWC) en el intervalo de 2000 a 15.000 NMWC; y -el filtro de producto en el intervalo de 50.000 NMWC a 2 !m.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el filtro de impurezas tiene un tamaño de poro de punto de corte de peso molecular (NMWC) de un máximo de 80 % del PM del biopolímero (por ejemplo un polipéptido) de interés, es decir, si el PM del polipéptido de interés es 100.000 el punto de corte máximo del filtro de impurezas es 80.000 NMWC; y en el que el filtro de producto de la reivindicación 2 tiene un tamaño de poro de punto de corte de peso molecular (NMWC) de al menos 1, 5 veces el PM del biopolímero (por ejemplo un polipéptido) de interés, es decir, si el PM del polipéptido de interés es 100.000 el punto de corte preferido del filtro de producto es al menos 150.000 NMWC.

7. El procedimiento de cualquiera de la reivindicaciones 2 a 6, en el que el polipéptido de interés es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, hormona del crecimiento humana, hormona de estimulación de folículo, Factor VIII, eritropoyetina (EPO) , factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , alfa-glactosidasa A, alfa-Liduronidasa (rhlDU; Iaronidasa) , N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa (rhASB; galsulfasa) , ADNasa, Activador de plasminógeno tisular (APT) , Glucocerebrosidasa, Interferón (IF) , Insulina, derivados de insulina, factor de crecimiento similar a insulina 1, Tenecteplasa, factor antihemofílico, factor de coagulación humana, Etanercept, Trastuzumab, Infliximab, Basiliximab, Daclizumab o Glucocerebrosidasa.

8. El procedimiento de cualquiera de la reivindicaciones 1 a 7, en el que la célula que expresa el polipéptido de interés es al menos una célula seleccionada del grupo que consiste en E. coli, Bacillus, levadura del género

Saccharomyces, Pichia, Aspergillus, Fusarium, Kluyveromyces, célula CHO (Ovario de Hámster Chino) , hibridomas, célula BHK (Riñón de Cría de Hámster) , célula de mieloma, célula HEK-293, célula Iinfoblastoide humana y una célula de ratón.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el biorreactor es de al menos 50 L y en la etapa (d) de la reivindicación 1 se añaden al menos 12 L de medio recién preparado al día que se eliminan/recogen mediante el filtro de impurezas y el módulo de recogida de producto de acuerdo con las etapas (b) y (c) de la reivindicación 1.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polipéptido de interés aislado de la etapa (e) de la reivindicación 1 se formula en una composición final comercial relevante de interés, tal como una composición farmacéutica de interés.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción Literatura diferente de patentes citadas en la descripción