Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH,

EC 1.1.99.3) recombinante o no, a partir de varios microorganismos como por ejemplo: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter industrius, Serratia marcescens Klebsiella pneumoniae y Eschericia coli y su uso como elemento de reconocimiento biológico en biosensores para la determinación del ácido glucónico en muestras de interés.

Biosensor bío-catalítico con transducción electroquímica libre de interferentes gracias a la alta selectividad de la enzima obtenida mediante el método detallado y estabilizada con los agentes químicos optimizados.

PROCESO DE PURIFICACiÓN Y ESTABILIZACiÓN DE LA ENZIMA GLUCONATO DESHIDROGENASA (GADH, EC 1.1.99.3) ; ENZIMA GLUCONATO DESHIDROGENASA (GADH, EC 1.1.99.3) ; y USO DE LA ENZIMA GLUCONATO DESHIDROGENASA (GADH, EC 1.1.99.3)

ESTADO DEL ARTE

Frente a los métodos analíticos convencionales (HPLC con varios detectores, espectrofotometría de absorción atómica, polarografía ... etc.) los métodos bioanalíticos han experimentado un gran interés gracias a la alta selectividad de los elementos de reconocimiento biológico. El ejemplo más revelante de este aumento de interés es la invención revolucionaria de los biosensores desde 1962 gracias a los trabajo de Clark y Lyon [L.C. Clark and C. Lyons, Ann. NY. A cad. Scí 120 (1962) 29]. Son dispositivos compactos que se basan en la integración intima de elementos de reconocimiento biológico en un sistema de transducción de la señal física [D.R Thévenot et al Pureo Appl. Chem 71 (1999) 2333]. El desarrollo de estos dispositivos pasa de forma genérica por tres líneas de investigación: la elección del sistema de transducción de la señal física adecuado, la inmovilización y/o la integración de este elemento en la superficie sensora, y la correlación de la señal generada con la presencia del analito de interés. Estos dispositivos compactos sufren la presencia de interferentes presentes en la matriz., lo que se puede paliar mediante desarrollos quimiométricos o aplicando al biosensor materiales compatibles con el ERB.

En el bagaje bibliográfico actual se pueden encontrar muchas invenciones centradas en esta última aproximación, la aplicación de capas protectoras que sirven tanto para proteger los ERBs de los posibles inhibidores como al sistema de transducción de la señal de los interferentes. De hecho se ha usado con abundancia y con mucho éxito polímeros biocompatibles como son el acetato de celulosa [H. Gunasingham et al, Bíosensors 4 (1989) 349; X. Ren et al Colloíds Surf B Bíoínterfaces 72 (2009) 188; R. Vaidya and E. Wilkins, Electroanalysís 6 (1994) 617; L.N. Wu et al Electrochím. Acta 51 (2006) 1208], el chitosano [J. Lin et al Sensors Actuators B: Chem 137 (2009) 768; S. Hikima et al, Fereseníu's. J. Anal. Chem 345 (1993) 607; H. Yu et al, Anal. Biochem 331 (2004) 98; G. Wang et al Bíosens. Bíoe/ectron 18 (2003) 335; X. Kang et al Bíosens. Bíoe/ectron 25 (2009) 901; J. Chem, E/ectroana/ísís 18 (2006) 670] Yel Nafion [M. EIKaoutit and Col WO/2009/022035; M. EIKaoutit and Col WO/2009/034200; J. Wang et al, J. Am. Chem. Soc 125 (2003) 2408; S. H. Lim, Bíosens. Bíoe/ectron 20 (2005) 2341; Y-C. Tsai et al Langmuír 21 (2005) 3653; A. A Kar y akin et al, Ana/. Chem 72 (2000) 1720; M. EIKaoutit et al J. Agríc. Food. Chem 55 (2007) 8011; M. EIKaoutit et al, Ta/anta 75 (2008) 1348; M. EIKaoutit et al, Bíosens. Bíoe/ectron 22 (2007) 2958].

La presente invención se ha centrado en una aproximación totalmente novedosa para evitar problemas de inhibición de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, 1.1.99.3) , protegerla y darle cierta durabilidad a temperatura ambiente en una matriz típicamente compleja como es el vino o el mosto de uva. Es destacable el hecho de que la sensibilidad a ciertos inhibidores e interferentes de las enzima puede depender del organismo de donde se extrae este elemento de reconocimiento biológico, de su proceso de purificación e incluso de los estabilizantes necesarios para mantener una cierta conformación estructural de la proteína. Se ha conseguido la purificación de la enzima GADH (1.1.99.3) a partir de varios microorganismos, mediante métodos muy novedosos y su estabilización en una disolución especifica. Como aplicación se han fabricado biosensores con simple retención física sobre una base conductora de una alícuota liquida de esta enzima mediante una membrana de diálisis junto con el mediador químico; sin aplicación de ninguna matriz de inmovilización ni un protector. El dispositivo resultante ha demostrado satisfactoria selectividad y estabilidad al acido glucónico como sustrato en matrices típicamente complejas como son el vino (muy rico en taninos y sulfitos) o/y el mosto de uva (con elevado grado de glucosa yacido ascórbico por ejemplo) .

El presente invento preconiza un proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, en la que la purificación de GADH se realiza a partir de células de SerraNa marcescens, K/eíbsella pneumoníae, Pseudomonas aerugínosa, Pseudomonas fluorescens, G/uconobacter oxydans, G/uconobacter índustríus o Eschericia coli o mezcla de ellas, y en el que la rotura celular se produce mediante sonicación u otro tipo de rotura física, procediéndose a obtener sus membranas, en el que:

a) las membranas se resuspenden por extrusión y

b) se realiza la solubilización de la enzima GADH de la membrana mediante la adicción de detergentes como n-Octyl-¡3-D-tioglucósido, Zwittergent 3-12, Twenn 80, Brij 58 o Triton X-100 en porcentajes v/v entre el 0, 1% Y el 3 %, se ultracentrifuga la suspensión y se recoge el sobrenadante,

c) se somete al sobrenadante a una cromatografía de intercambio iónico a un pH entre 4 y 8, 5.

También se caracteriza porque a la enzima GADH así purificada se le añade:

acido glucónico a una concentración entre 5 y 20 mM;

una concentración v/v de glicerol entre el 10 Y el 50%;

detergentes como n-Octyl-¡3-D-tioglucósido, Zwittergent 3-12, Twenn 80, Brij 58 o Triton X-1 00 a una concentración v/v entre el 0.05 y 2%;

un catión divalente que puede ser MgCI2, CaCI2 o BaCI2 a una concentración entre 1 y 10 mM; y

uno o varios de los siguientes hidratos de carbono en una concentración v/v entre el 1 y el 20%; trehalosa, malitol, manitol, sorbitol, dextran y Ficoll™.

También es objeto de la invención la Enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH) obtenida de acuerdo con este proceso.

Así mismo, es objeto de la invención el uso de la enzima, obtenida de acuerdo con el proceso anteriormente descrito, como elemento de reconocimiento biológico para el desarrollo de dispositivos de medida del sustrato enzimático ácido glucónico.

También es objeto del invento el uso de la enzima, obtenida de acuerdo con el proceso anteriormente descrito, para medir los valores de ácido glucónico en muestras alimentarias, por ejemplo, mostos y vinos.

EXPLICACiÓN DE UNA FORMA DE REALIZACiÓN PREFERENTE

Para una mejor comprensión de la presente invención, se exponen los siguientes ejemplos, descritos en detalle, que deben entenderse sin carácter limitativo del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1. Purificación de gluconato 2-deshidrogenasa (GADH, 1.1.99.3) a partir de Pseudomonas aeruginosa

La cepa bacteriana utilizada para esta invención, Pseudomonas aerugínosa CECT 108, puede ser cultivada en cualquier medio que induzca el ciclo de las pentosas fosfato.

En el paso de producción se emplearon 2 matraces Erlenmeyer de 2 litros, cada uno conteniendo 600 mi de medio, que habían sido inoculados con un 10% de volumen de cultivo crecido en el mismo medio hasta obtener una 00600=2, 5. Los cultivos fueron incubados a 28ºC hasta su fase exponencial tardía (aproximadamente 12 horas) .

Los cultivos fueron centrifugados durante 45 minutos a 9000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se recogió el precipitado. La masa celular fue conservada en congelación a -80ºC hasta el momento de su ruptura.

Para comenzar la ruptura de las células, se descongelaron y se resuspendieron en 5 veces su volumen en tampón acetato 50 mM y un pH=4.5 de ruptura. Se añadieron 5 mg/ml de lisozima e inhibidor de proteasas y se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. En este momento, se añadió 0, 5 mi de ONAsa II 1 mg/ml en NaCI 0, 15 M Y se mantuvieron las células en agitación en el tampón descrito a 4ºC hasta el día siguiente.

Más tarde las células se sometieron a 6 pulsos de sonicación, con un 50% de amplitud. Se centrifugaron, para separar las células no rotas y las paredes celulares (precipitado) del sobrenadante, que contenía las proteínas citoplasmáticas y las membranas celulares en suspensión. Se evitó recoger el sobrenadante de mayor densidad, que quedaba sobre el precipitado, por la dificultad que suponía la separación de las proteínas citoplasmáticas de las proteínas de... [Seguir leyendo]

1. Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, en la que la purificación de GADH se realiza a partir de células de SerraNa marcescens, Kleíbsella pneumoníae, Pseudo monas aerugínosa, Pseudomonas fluorescens, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter índustríus o Eschericia coli o mezcla de ellas, y en el que la rotura celular se produce mediante sonicación u otro tipo de rotura física, procediéndose a obtener sus membranas, caracterizado porque:

a) las membranas se resuspenden por extrusión y

b) se realiza la solubilización de la enzima GADH de la membrana mediante la adicción de detergentes como n-Octyl-¡3-D-tioglucósido, Zwittergent 3-12, Twenn 80, Brij 58 o Triton X-100 en porcentajes v/v entre el 0, 1% Y el 3 %, se ultracentrifuga la suspensión y se recoge el sobrenadante,

c) se somete al sobrenadante a una cromatografia de intercambio iónico a un pH entre 4 y 8, 5.

2. Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, según reivindicación 1, caracterizado porque a la enzima GADH así purificada se le añade acido glucónico a una concentración entre 5 y 20 mM.

3. Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, según reivindicación 2, caracterizado porque a la enzima GADH así purificada se le añade una concentración v/v de glicerol entre el 10 Y el 50%.

4. Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque a la enzima GADH así purificada se le añade detergentes como n-Octyl-¡3-D-tioglucósido, Zwittergent 3-12, Twenn 80, Brij 58 o Triton X-1 00 a una concentración v/v entre el 0.05 y 2%.

5. Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque a la enzima GADH así purificada se le añade un catíon divalente que puede ser MgCI2, CaCI2 o BaCI2 a una

concentración entre 1 y 10 mM

6. Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque a la enzima GADH así purificada se le añade uno o varios de los siguientes hidratos de carbono en una

concentración v/v entre el 1 y el 20%; trehalosa, malitol, manitol, sorbitol, dextran y Ficoll™.

7. Enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, obtenida de acuerdo con el proceso de las anteriores reivindicaciones.

8. Uso de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3)

recombinante o no, obtenida de acuerdo con el proceso de las anteriores reivindicaciones, para medir los valores de acido glucónico en muestras alimentarias.