Una composición farmacéutica de α-Gal A en la cual al menos el 50% de los glucanos totales de dichapreparación de α

-Gal A son glucanos de tipo complejo para su uso en el tratamiento de una deficiencia de α-Gal A auna dosificación semanal o quincenal de entre 0,05 mg y 5,0 mg de una preparación de α-Gal A por kg de pesocorporal de un sujeto.

Preparaciones médicas para el tratamiento de deficiencia de alfa-galactosidasa A

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para el tratamiento de la deficiencia de agalactosidasa A.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Fabr y es una enfermedad de almacenamiento lisosomal hereditaria ligada al cromosoma X caracterizada por disfunción renal grave, angioqueratomas y anomalías cardiovasculares, incluyendo dilatación ventricular e insuficiencia de la válvula mitral. La enfermedad de Fabr y también afecta al sistema nervioso periférico, provocando episodios de dolor angustioso, ardiente en las extremidades. La enfermedad de Fabr y está provocada por una deficiencia de la enzima a-galactosidasa A (a-Gal A) . La a-Gal A es la glicohidrolasa lisosomal que escinde los restos a-galactosilo terminales de diversos glicoconjugados. La enfermedad de Fabr y da como resultado un bloqueo del catabolismo del glicoesfingolípido neutro, trihexósido de ceramida (CTH) y la acumulación de este sustrato enzimático dentro de las células y en el torrente sanguíneo.

Debido al patrón de herencia ligada al cromosoma X de la enfermedad, la mayoría de los pacientes con la enfermedad de Fabr y son hombres. Aunque se han observado mujeres heterocigóticas gravemente afectadas, las mujeres heterocigóticas son a menudo asintomáticas o tienen síntomas relativamente leves (tales como una opacidad característica de la córnea) . Una variante atípica de la enfermedad de Fabr y , que muestra baja actividad residual de la a-Gal A y o bien síntomas muy leves o bien aparentemente ningún otro síntoma característico de la enfermedad de Fabr y , se correlaciona con la hipertrofia ventricular izquierda y enfermedad cardiaca. Nakano et al., New Engl. J. Med. 333: 288-293 (1995) . Una reducción en la a-Gal A puede ser la causa de tales anomalías cardiacas.

El ADNc y el gen que codifica para la a-Gal A humana se han aislado y secuenciado. La a-Gal A humana se expresa como un polipéptido de 429 aminoácidos, de los cuales los 31 aminoácidos N-terminales son el péptido señal. La enzima humana se ha expresado en células de ovario de hámster chino (CHO) (Desnick et al ., patente estadounidense 5.356.804; Ioannou et al ., J. Cell Biol. 119: 1137 (1992) ) ; y células de insecto (Calhoun et al., documento WO 90/11353) .

Sin embargo, las preparaciones actuales de a-Gal A tienen eficacia limitada. Los procedimientos para la preparación de a-Gal A con pureza relativamente alta dependen del uso de cromatografía de afinidad, usando una combinación de cromatografía de afinidad de lectina (concanavalina A (Con A) Sepharose®) y cromatografía de afinidad basada en la unión de a-Gal A al análogo de sustrato N-6-aminohexanoil-a-D-galactosilamina acoplado a una matriz de Sepharose®. Véase, por ejemplo, Bishop et al., J. Biol. Chem. 256: 1307-1316 (1981) . El uso de resinas de afinidad de lectina proteináceas y resinas de análogo de sustrato está asociado normalmente con la lixiviación continua del agente de afinidad del soporte sólido (Marikar et al., Anal. Biochem. 201: 306-310 (1992) , dando como resultado la contaminación del producto purificado con el agente de afinidad o bien libre en disolución o bien unido a la proteína eluida. Tales contaminantes hacen que el producto no sea adecuado para su uso en preparaciones farmacéuticas. Las lectinas y análogos de sustrato unidos también pueden tener efectos negativos sustanciales sobre las propiedades enzimáticas, funcionales y estructurales de las proteínas. Además, la a-Gal A producida mediante los procedimientos de la técnica anterior se elimina rápidamente por el hígado.

Por tanto, sigue habiendo una necesidad en la técnica de un protocolo de purificación que use resinas de cromatografía convencionales, que esté fácilmente disponible en suministros y calidad adecuados para su uso comercial a gran escala y que produzca una preparación de a-Gal A que esté libre de agente de afinidad. Además, sigue habiendo una necesidad en la técnica de preparaciones de a-Gal A con una semivida en circulación aumentada y captación aumentada en tejidos específicos diferentes del hígado.

El documento WO98/11206 describe la producción de a-Gal A humana en células transgénicas, que puede usarse para tratar a pacientes que padecen una deficiencia de a-Gal A. Las células transgénicas pueden administrarse directamente a un paciente, o puede administrarse la a-Gal A transgénica como una preparación farmacéutica.

Sumario de la invención

La invención proporciona una composición farmacéutica de a-Gal A en la cual al menos el 50% de los glucanos totales de dicha preparación de a-Gal A son glucanos de tipo complejo para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A a una dosificación semanal o quincenal de entre 0, 05 mg y 5, 0 mg de una preparación de a-Gal A por kg de peso corporal de un sujeto.

Otras características se describen en las reivindicaciones dependientes.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una representación de la sonda de 210 pb que se usó para aislar un ADNc de a-Gal A a partir de una biblioteca de ADNc de fibroblastos humanos (SEQ ID NO: 1) . La secuencia es desde el exón 7 del gen de a-Gal A. La sonda se aisló a partir de ADN genómico humano mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Las regiones subrayadas en la figura corresponden a las secuencias de los cebadores de amplificación.

La figura 2 es una representación de la secuencia del fragmento de ADN que completa el extremo 5’ del clon de ADNc de a-Gal A (SEQ ID NO: 2) . Este fragmento se amplificó a partir de ADN genómico humano mediante PCR. Las regiones subrayadas corresponden a las secuencias de los cebadores de amplificación. También se muestran las posiciones de los sitios de endonucleasas de restricción NcoI y SacII, que se usaron para la subclonación tal como se describe en el ejemplo 1.

La figura 3 es una representación de la secuencia de ADNc de a-Gal A, incluyendo la secuencia que codifica para el péptido señal (SEQ ID NO: 3) .

La figura 4 es un mapa esquemático de pXAG-16, un constructo de expresión de a-Gal A que incluye el promotor de CMV (citomegalovirus) , el exón 1 y el primer intrón, la secuencia que codifica para el péptido señal de hGH y el primer intrón, el ADNc de a-Gal A (que carece de la secuencia del péptido señal de a-Gal A) y la UTS en 3’ de hGH. pcDNeo indica la posición del gen neo derivado del plásmido pcDNeo.

La figura 5 es un mapa esquemático de pXAG-28, un constructo de expresión de a-Gal A que incluye el promotor Ia2 del colágeno y el primer exón, un intrón de º-actina, la secuencia que codifica para el péptido señal de hGH y el primer intrón, el ADNc de a-Gal A (que carece de la secuencia de péptido señal de a-Gal A) y la UTS en 3’de hGH. pcDNeo indica la posición del gen neo derivado del plásmido pcDNeo.

La figura 6 es una representación de la secuencia de aminoácidos de a-Gal A humana (SEQ ID NO: 4) .

La figura 7 es una representación de la secuencia de ADNc que codifica para la a-Gal A humana (sin péptido señal) (SEQ ID NO 5) .

La figura 8 es un cromatograma de la etapa de purificación de a-Gal A usando resina de butil-Sepharose®. Se muestra la absorbancia a 280 nm (línea sencilla) y la actividad a-Gal A (línea de puntos) de las fracciones seleccionadas.

La figura 9 es un mapa esquemático de pGA213C.

La figura 10 es una representación esquemática del constructo de selección como diana, pGA213C, y la recombinación homóloga con el locus de a-galactosidasa A endógena. pGA213C se representa como secuencias de selección como diana alineadas por encima con secuencias correspondientes en el locus de a-galactosidasa A del cromosoma X. Las posiciones relativas respecto al codón de iniciación de metionina, ATG, se indican mediante los números por encima de los mapas lineales. La unidad de activación que contiene las secuencias de dhfr murina, neo bacteriana y promotor de CMV/intrón de aldolasa se muestran por encima de la posición (-221) en la que se insertaron mediante clonación de ADN. Las secuencias que codifican para a-galactosidasa A se indican mediante los recuadros oscurecidos. Las secuencias genómicas que no codifican para a-galactosidasa A se indican mediante recuadros ligeramente rellenados. Las flechas grandes indican la... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica de a-Gal A en la cual al menos el 50% de los glucanos totales de dicha preparación de a-Gal A son glucanos de tipo complejo para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A a una dosificación semanal o quincenal de entre 0, 05 mg y 5, 0 mg de una preparación de a-Gal A por kg de peso corporal de un sujeto.

2. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según la reivindicación 1 en la cual la deficiencia de a-Gal A es la enfermedad de Fabr y .

3. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según la reivindicación 2, en la cual la deficiencia de a-Gal A es una variante atípica de la enfermedad de Fabr y .

4. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según la reivindicación 2 o 3, en el cual dicho sujeto sufre de una anomalía cardiovascular.

5. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según la reivindicación 4, en la cual la anomalía cardiovascular es una anomalía ventricular izquierda (LVH) .

6. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la cual dicha dosis es de entre 0, 1 y 0, 3 mg de dicha preparación de a-Gal A por kg de peso corporal de un sujeto.

7. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha dosis se formula para su administración subcutánea.

8. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según la reivindicación 6, en la cual dicha dosis es de aproximadamente 0, 2 mg de dicha preparación de a-Gal A por kg de peso corporal de un sujeto.

9. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según las reivindicaciones 1, 6 u 8, en la cual dicha dosis se formula para su administración por vía intramuscular, vía oral, vía rectal, vía subcutánea, vía intraarterial, vía intraperitoneal, vía intracerebral, vía intranasal, vía intratecal, vía transmucosal, vía transdérmica o mediante inhalación.

10. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según las reivindicaciones 1-6 u 8, en la cual dicha dosis se formula para su administración usando un sistema de administración seleccionado del grupo que consiste en administración con bomba, administración de células encapsuladas, administración liposomal, inyección administrada con aguja, inyección sin aguja, nebulizador, pulverizador, electroporación y parche transdérmico.

11. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en la cual el sujeto muestra un síntoma de la enfermedad de Fabr y .

12. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 6-10, en la cual el sujeto exhibe un síntoma de la enfermedad de Fabr y clásica.

13. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 6-10, en la cual el sujeto exhibe un síntoma de una variante atípica de la enfermedad de Fabr y .

14. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 6-10, en la cual el sujeto exhibe un síntoma de disfunción cardiaca.

15. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 6-10, en la cual el sujeto exhibe un síntoma de disfunción renal.

16. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una deficiencia de a-Gal A según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 6-10, en la cual el sujeto muestra al menos un síntoma seleccionado del grupo que consiste en distrofia de la córnea, angioqueratoma, neuropatía dolorosa, enfermedad vascular cerebral, cardiomiopatía, hipertrofia ventricular izquierda, disnea por esfuerzo, hipertrofia septal asimétrica, infarto de miocardio, cardiomiopatía e infiltración miocárdica.