Un método para aumentar la caducidad de un complejo de lípido:

ácido nucleico, comprendiendo dicho métodolas etapas de:

poner en contacto un ácido nucleico con un policatión orgánico para producir un ácido nucleico condensado;combinar dicho ácido nucleico condensado con un lípido que comprende un lípido catiónico anfifílico para producirdicho complejo de lípido:ácido nucleico;

mezclar dicho complejo de lípido:ácido nucleico con un polímero hidrófilo neutro; y

conservar dicho complejo de lípido:ácido nucleico antes de su uso;

en el que dicho complejo de lípido:ácido nucleico que comprende dicho ácido nucleico condensado tiene unamayor caducidad, comparado con un complejo de lípido:ácido nucleico idéntico que carece de dicho policatiónorgánico.

Preparación de formulaciones estables de complejos de lípido-ácido nucleico para el suministro eficaz in vivo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los complejos de lípido catiónico:ADN (“CLDC”) . En particular, la presente invención se refiere a complejos de lípido:ácido nucleico que contienen (1) un polímero hidrófilo; (2) un ácido nucleico que se ha condensado con policationes orgánicos; y (3) un polímero hidrófilo y un ácido nucleico que han sido condensados con policationes orgánicos. Los complejos de lípido:ácido nucleico de esta invención muestran una alta actividad de transfección in vivo tras la inyección intravenosa y una aumento inesperado en la caducidad, según se determina mediante la actividad de transfección in vivo.

Antecedentes de la invención

Los liposomas que consisten en moléculas catiónicas anfifílicas son vectores no víricos útiles para el transporte de genes in vitro e in vivo (publicado en Cr y stal, Science, 270:404-410 (1995) ; Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2:291297 (1995) ; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5:382-389 (1994) ; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5:647-654 (1994) ; y Gao et al., Gene Therapy, 2:710-722 (1995) ) . En teoría, los liposomas cargados positivamente forman complejos con ácidos nucleicos cargados negativamente a través de interacciones electrostáticas para formar complejos de lípido:ácido nucleico. Los complejos de lípido:ácido nucleico tienen varias ventajas como vectores de transferencia de genes. A diferencia de los vectores víricos, los complejos de lípido:ácido nucleico pueden utilizarse para transferir módulos de expresión con un tamaño casi ilimitado. Puesto que los complejos no contienen proteínas, pueden evocar menos respuestas inmunogénicas e inflamatorias. Además, no pueden replicarse ni recombinarse para formar un agente infeccioso y tienen baja frecuencia de integración.

Existe una serie de publicaciones que demuestran de modo convincente que los lípidos catiónicos anfifílicos pueden mediar en el transporte de genes in vivo e in vitro, mostrando la expresión detectable de un gen indicador en células cultivadas in vitro (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987) ; Loeffler et al., Methods in Enzymology, 217:599-618 (1993) ; Felgner et al., J. Biol. Chem., 269:2550-2561 (1994) ) . Debido a que los complejos de lípido:ácido nucleico a veces no son tan eficaces como los vectores víricos para lograr una transferencia de genes satisfactoria, se han realizado muchos esfuerzos por encontrar lípidos catiónicos con mayor eficacia de transfección (Behr, Bioconjugate Chem., 5:382-389 (1994) ; Remy et al., Bioconjugte Chem., 5:647-654 (1994) ; Gao et al., Gene Therapy, 2:710-722 (1995) ) . Los complejos de lípido:ácido nucleico son considerados con entusiasmo una herramienta potencialmente útil para la terapia génica.

Varios grupos han informado del uso de complejos de lípido catiónico anfifílico:ácido nucleico para la transfección in vivo, en animales y en seres humanos (publicado en Gao et al., Gene Therapy, 2:710-722 (1995) ; Zhu et al., Science, 261:209-211 (1993) ; y Thierr y et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9742-9746 (1995) ) . Sin embargo, los problemas técnicos para la preparación de complejos que tengan caducidades estables no se han solucionado. Por ejemplo, a diferencia de las preparaciones de vectores víricos, los complejos de lípido:ácido nucleico son inestables con respecto al tamaño de partícula (Behr, Bioconjugte Chem., 5:382-389 (1994) ; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5:647-654 (1994) ; Gao et al., Gene Therapy, 2:710-722 (1995) ) . Por tanto, es difícil obtener complejos de lípido:ácido nucleico homogénos con una distribución de tamaño adecuada para la inyección sistémica. La mayoría de las preparaciones de complejos de lípido:ácido nucleico son metaestables. Por consiguiente, estos complejos generalmente deben utilizarse dentro de un corto periodo de tiempo que varía de 30 minutos a unas pocas horas. En ensayos clínicos recientes que emplean lípidos catiónicos como portadores para el transporte de ADN, los dos componentes se mezclan junto a la cama y se emplean inmediatamente (Gao et al., Gene Therapy, 2:710-722 (1995) ) . La inestabildad estructural, junto con la pérdida de actividad de transfección del complejo de lípido:ácido nucleico a lo largo del tiempo, son desafíos para el futuro desarrollo de la terapia génica mediada por lípidos.

El documento FR-A-1.722.506 describe composiciones que contienen uno o más ácidos nucleicos y polímeros catiónicos, y su uso en terapia génica, en particular para la transferencia de ácidos nucleicos in vivo. El documento EP-A-0.394.111 describe compuestos de lipopoliamina, indicándose que se asocian con ADN y facilitan la transfección de células con ADN. El documento WO 96/14864 describe liposomas que comprenden un dominio Fab’ de un anticuerpo que dirige los liposomas a células que portan un marcador en la superficie celular.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un nuevo método para preparar complejos de lípido catiónico:ácido nucleico que tienen mayor caducidad. En una realización, estos complejos se preparan mediante un método que comprende las etapas de:

poner en contacto un ácido nucleico con un policatión orgánico para producir un ácido nucleico condensado;

combinar dicho ácido nucleico condensado con un lípido que comprende un lípido catiónico anfifílico para producir dicho complejo de lípido:ácido nucleico;

mezclar dicho complejo de lípido:ácido nucleico con un polímero hidrófilo neutro; y

conservar dicho complejo de lípido:ácido nucleico antes de su uso;

en el que dicho complejo de lípido:ácido nucleico que comprende dicho ácido nucleico condensado tiene una mayor caducidad, comparado con un complejo de lípido:ácido nucleico idéntico que carece de dicho policatión orgánico.

El ácido nucleico condensado puede combinarse con un lípido catiónico anfifílico más un lípido auxiliar neutro, tal como colesterol, en una proporción molar de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2, para producir el complejo de lípido:ácido nucleico.

La invención también proporciona un método para aumentar la caducidad de un complejo de lípido:ácido nucleico, comprendiendo dicho método las etapas de:

combinar un ácido nucleico con un lípido que comprende un lípido catiónico anfifílico para producir dicho complejo de lípido:ácido nucleico; y

mezclar dicho complejo de lípido:ácido nucleico con un polímero hidrófilo con carga neutra;

en el que dicho complejo de lípido:ácido nucleico tiene una mayor caducidad, comparado con un complejo de lípido:ácido nucleico idéntico que carece de dicho polímero hidrófilo.

Estos complejos de lípido:ácido nucleico tienen una mayor caducidad, por ejemplo, cuando se conservan a 22 ºC o menos, comparados con un complejo de lípido:ácido nucleico idéntico en el que el componente de ácido nucleico no se ha puesto en contacto con el policatión orgánico y/o en el que el complejo de lípido:ácido nucleico no se ha puesto en contacto con un polímero hidrófilo.

En una realización particularmente preferida, el policatión es una poliamina, más preferiblemente una poliamina tal como espermidina o espermina.

En una realización, el polímero hidrófilo se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , polietilenglicol derivatizado con fosfatidiletanolamina (PEG-PE) , polietilenglicol derivatizado con Tween, polietilenglicol derivatizado con diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSPE) , gangliósido GM1 y polímeros sintéticos.

En una realización, el complejo de lípido:ácido nucleico está liofilizado.

En cualquiera de los métodos y de las composiciones de esta invención, el ácido nucleico puede ser casi cualquier ácido nucleico, por ejemplo, un ácido desoxirribonucleico (ADN) o un ácido ribonucleico (ARN) , y un ácido nucleico peptídico (PNA) , y más preferiblemente es un ADN. En una realización particularmente preferida, el ADN es un módulo de expresión capaz de expresar un polipéptido en una célula transfectada con el complejo de lípido:ácido nucleico.

En una realización, los complejos de lípido:ácido nucleico se forman formando en primer lugar un liposoma, y después... [Seguir leyendo]

1. Un método para aumentar la caducidad de un complejo de lípido:ácido nucleico, comprendiendo dicho método las etapas de:

poner en contacto un ácido nucleico con un policatión orgánico para producir un ácido nucleico condensado; combinar dicho ácido nucleico condensado con un lípido que comprende un lípido catiónico anfifílico para producir dicho complejo de lípido:ácido nucleico;

mezclar dicho complejo de lípido:ácido nucleico con un polímero hidrófilo neutro; y conservar dicho complejo de lípido:ácido nucleico antes de su uso; en el que dicho complejo de lípido:ácido nucleico que comprende dicho ácido nucleico condensado tiene una

mayor caducidad, comparado con un complejo de lípido:ácido nucleico idéntico que carece de dicho policatión

orgánico.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho policatión orgánico se selecciona del grupo que consiste en poliamina, poliamonio, poliaminoácido básico, y proteína básica.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicha poliamina se selecciona del grupo que consiste en espermina,

espermidina, y proteína básica. 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN y ARN.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho ácido nucleico es ADN. 6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha etapa de combinar dicho ácido

nucleico condensado con dicho lípido comprende formar en primer lugar un liposoma que comprende dicho lípido catiónico anfifílico. 7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha etapa de combinar dicho ácido

nucleico condensado con dicho lípido comprende combinar dicho lípido y dicho ácido nucleico en una proporción

que varía de 1 a 20 nmol de lípido:!g de ácido nucleico. 8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha etapa de poner en contacto dicho ácido nucleico con dicho policatión orgánico comprende poner en contacto dicho policatión orgánico y dicho ácido nucleico en una proporción que varía de 0, 05 a 5, 0 nmol de policatión orgánico:!g de ácido nucleico.

9. El método de la reivindicación 1, en el que dicho método comprende las etapas de:

poner en contacto un módulo de expresión con una poliamina seleccionada del grupo que consiste en espermidina y espermina, para producir un módulo de expresión condensado; y combinar dicho módulo de expresión condensado con un lípido que comprende DDAB (bromuro de

didodecildimetilamino) y colesterol con una proporción molar de 2:1 a 1:2, para producir un complejo de

lípido:módulo de expresión; en el que dicho complejo de lípido:módulo de expresión que comprende dicho módulo de expresión condensado tiene una mayor caducidad a aproximadamente 4 ºC, comparado con un complejo de lípido:módulo de expresión idéntico que carece de dicha poliamina.

10. El método de la reivindicación 1, en el que dicho polímero hidrófilo está unido a un resto de transporte dirigido. 11. El método de la reivindicación 10, en el que dicho resto de transporte dirigido es un anticuerpo. 12. El método de la reivindicación 10, en el que dicho resto de transporte dirigido es un fragmento de anticuerpo. 13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho complejo de lípido:ácido

nucleico está liofilizado. 14. Un método para aumentar la caducidad de un complejo de lípido:ácido nucleico, comprendiendo dicho método las etapas de:

combinar dicho ácido nucleico con un lípido que comprende un lípido catiónico anfifílico para producir dicho complejo de lípido:ácido nucleico; y mezclar dicho complejo de lípido:ácido nucleico con un polímero hidrófilo con carga neutra;

en el que dicho complejo de lípido:ácido nucleico tiene una mayor caducidad, comparado con un complejo de lípido:ácido nucleico idéntico que carece de dicho polímero hidrófilo.

15. El método de la reivindicación 14, en el que dicho polímero hidrófilo se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , polietilenglicol derivatizado con fosfatidiletanolamina (PEG-PE) , polietilenglicol derivatizado con un ácido graso de sorbitán, polietilenglicol derivatizado con diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSPE) , y gangliósido GM1.

16. El método de la reivindicación 14 o 15, en el que dicho ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN y ARN.

17. El método de la reivindicación 14 o 15, en el que dicho ácido nucleico es ADN.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 17, en el que dicha etapa de combinar dicho ácido nucleico con dicho lípido comprende formar en primer lugar un liposoma que comprende dicho lípido catiónico anfifílico.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que dicha etapa de combinar dicho ácido nucleico con dicho lípido comprende combinar dicho lípido y dicho ácido nucleico en una proporción que varía de 1 a 20 nmol de lípido:!g de ácido nucleico.

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, en el que dicha etapa de mezclar dicho complejo de lípido:ácido nucleico con dicho polímero hidrófilo comprende mezclar dicho polímero hidrófilo y dicho complejo de lípido:ácido nucleico en una proporción molar del 0, 1% al 10% de polímero hidrófilo al lípido dentro del complejo de lípido:ácido nucleico.

21. El método de la reivindicación 14, en el que dicho método comprende las etapas de:

combinar un módulo de expresión con dicho lípido que comprende dicho lípido catiónico anfifílico, para producir un complejo de lípido:módulo de expresión; y

mezclar dicho complejo de lípido:módulo de expresión con polietilenglicol derivatizado con fosfatidiletanolamina (PEG-PE) ;

en el que dicho complejo de lípido:módulo de expresión tiene una mayor caducidad a aproximadamente 4 ºC, comparado con un complejo de lípido:módulo de expresión idéntico que carece de dicho polietilenglicol derivatizado con fosfatidiletanolamina (PEG-PE) .

22. El método de la reivindicación 21, en el que dicho lípido comprende polietilenglicol unido a un fragmento Fab’ de un anticuerpo.

23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, en el que dicho complejo de lípido:ácido nucleico está liofilizado.

24. El uso de un complejo de lípido:ácido nucleico que comprende:

un ácido nucleico que se ha puesto en contacto con un policatión orgánico seleccionado de poliamonio, poliaminoácido básico, proteína básica, espermina y espermidina, para producir un ácido nucleico condensado;

un lípido que comprende un lípido catiónico anfifílico; y

un polímero hidrófilo neutro;

para la fabricación de un medicamento para transfectar una célula con dicho ácido nucleico después de su conservación.

25. El uso de la reivindicación 24, en el que dicho complejo de lípido:ácido nucleico se conserva a una temperatura de aproximadamente 22 ºC o menor.

26. El uso de la reivindicación 24, en el que dicho ácido nucleico es ADN.

27. El uso de la reivindicación 24, 25 o 26, en el que dicho medicamento es para la administración a un mamífero.

28. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en el que dicho complejo comprende polietilenglicol unido a un fragmento Fab’ de un anticuerpo.

29. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que dicho complejo de lípido:ácido nucleico se conserva a una temperatura de aproximadamente 22 ºC o menor.

30. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, en el que dicho polímero hidrófilo con carga neutra se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , polietilenglicol derivatizado con fosfatidiletanolamina (PEG-PE) , polietilenglicol derivatizado con un ácido graso de sorbitán, polietilenglicol derivatizado con diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSPE) , y gangliósido GM1.

31. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 30, en el que dicho ácido nucleico es ADN.

32. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31, en el que dicho complejo de lípido:ácido nucleico es para la administración sistémica a un mamífero. 33. El uso de la reivindicación 32, en el que dicho complejo de lípido:ácido nucleico es para la administración

intravenosa a un mamífero.

34. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 33, en el que dicho polímero hidrófilo neutro está unido a un resto de transporte dirigido. 35. El uso de la reivindicación 34, en el que dicho resto de transporte dirigido es un anticuerpo. 36. El uso de la reivindicación 34, en el que dicho resto de transporte dirigido es un fragmento de anticuerpo. 37. Un complejo de lípido:ácido nucleico que comprende:

un ácido nucleico que se ha puesto en contacto con un policatión orgánico seleccionado del grupo que consiste en poliamonio, poliaminoácido básico, proteína básica, espermina y espermidina, para producir un ácido nucleico condensado;

un lípido que comprende un lípido catiónico anfifílico; y un polímero hidrófilo neutro; en el que dicho complejo de lípido:ácido nucleico tiene una mayor caducidad, comparado con un complejo de

lípido:ácido nucleico idéntico que carece de dicho policatión orgánico.

38. El complejo de la reivindicación 37, en el que dicho policatión orgánico se selecciona del grupo que consiste en poliamonio y poliaminoácido básico. 39. El complejo de la reivindicación 38, en el que dicha poliamina se selecciona del grupo que consiste en

espermina y espermidina.

40. El complejo de la reivindicación 37, 38 o 39, en el que dicho ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN y ARN. 41. El complejo de la reivindicación 37, 38 o 39, en el que dicho ácido nucleico es ADN. 42. El complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41, en el que la cantidad de dicho lípido y dicho

ácido nucleico está en una proporción que varía de 1 a 20 nmol de lípido:!g de ácido nucleico. 43. El complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41, en el que dicho ácido nucleico se pone en

contacto con dicho policatión orgánico en una proporción que varía de 0, 05 a 5, 0 nmol de policatión orgánico:!g de ácido nucleico. 44. El complejo de la reivindicación 37, en el que dicho complejo comprende:

un módulo de expresión que se ha puesto en contacto con una poliamina seleccionada del grupo que consiste en espermidina y espermina, para producir un módulo de expresión condensado; y

dicho lípido comprende dicho lípido catiónico anfifílico; en el que dicho complejo de lípido:módulo de expresión tiene una mayor caducidad a aproximadamente 4 ºC, comparado con un complejo de lípido:módulo de expresión idéntico que carece de espermidina o espermina.

45. El complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 44, en el que dicho complejo comprende polietilenglicol unido a un fragmento Fab’ de un anticuerpo.

46. Una composición farmacéutica que comprende: un ácido nucleico condensado con un policatión orgánico seleccionado de poliamonio, poliaminoácido básico, proteína básica, espermina y espermidina, complejado con:

un lípido que comprende un lípido catiónico anfifílico; y un polímero hidrófilo neutro;

en un vehículo farmacéuticamente aceptable; en la que dicha composición farmacéutica tiene una mayor caducidad, comparado con una composición farmacéutica idéntica que carece de dicho policatión orgánico.

47. La composición de la reivindicación 46, en la que dicho policatión orgánico se selecciona del grupo que consiste en poliamonio, poliaminoácido básico, y proteína básica. 48. La composición de la reivindicación 47, en la que dicho policatión orgánico se selecciona del grupo que consiste

en espermina y espermidina. 49. La composición de la reivindicación 46, 47 o 48, en la que dicho ácido nucleico es ADN. 50. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 49, en la que la cantidad de dicho lípido y dicho

ácido nucleico está en un intervalo que varía de 1 a 20 nmol de lípido:!g de ácido nucleico. 51. La composición de la reivindicación 46, en la que dicha composición comprende:

un módulo de expresión que se ha puesto en contacto con una poliamina seleccionada del grupo que consiste en espermidina y espermina, para producir un módulo de expresión condensado; y dicho lípido que comprende dicho lípido catiónico anfifílico; en la que dicha composición tiene una mayor caducidad a aproximadamente 4 ºC, comparado con una

composición idéntica que carece de dicha poliamina.

52. La composición de la reivindicación 51, en la que dicho complejo comprende polietilenglicol unido a un fragmento Fab’ de un anticuerpo. 53. Un kit para preparar un complejo de lípido:ácido nucleico, comprendiendo dicho kit:

(i) un recipiente que contiene un liposoma que comprende un lípido catiónico anfifílico;

(ii) un recipiente que contiene un ácido nucleico; y

(iii) un recipiente que contiene un polímero hidrófilo neutro;

en el que el liposoma y el ácido nucleico se van a mezclar para formar el complejo de lípido:ácido nucleico, y en el que el complejo de lípido:ácido nucleico se va a poner en contacto con el polímero hidrófilo.

54. Un kit de la reivindicación 53, en el que dicho polímero hidrófilo está derivatizado con un resto de transporte

dirigido. 55. Un kit de la reivindicación 54, en el que dicho resto de transporte dirigido es un fragmento Fab’. 56. Un kit de la reivindicación 53, 54 o 55, en el que dicho ácido nucleico es un ácido nucleico condensado. 57. El uso de:

(i) un ácido nucleico que se ha puesto en contacto con un policatión orgánico para producir un ácido nucleico condensado;

(ii) un lípido que comprende un lípido catiónico anfifílico; y

(iii) un polímero hidrófilo neutro;

para producir un complejo de lípido:ácido nucleico para su conservación antes del uso;

en el que dicho complejo de lípido:ácido nucleico tiene una mayor caducidad, comparado con un complejo de lípido:ácido nucleico idéntico que carece de dicho policatión orgánico.

58. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho polímero hidrófilo se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , polietilenglicol derivatizado con fosfatidiletanolamina (PEG-PE) , polietilenglicol derivatizado con un ácido graso de sorbitán, polietilenglicol derivatizado con diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSPE) , y gangliósido GM1.

59. El complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 44, en el que dicho polímero hidrófilo se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , polietilenglicol derivatizado con fosfatidiletanolamina (PEG-PE) , polietilenglicol derivatizado con un ácido graso de sorbitán, polietilenglicol derivatizado con diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSPE) , y gangliósido GM1.

60. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 51, en la que dicho polímero hidrófilo se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , polietilenglicol derivatizado con fosfatidiletanolamina (PEG-PE) , polietilenglicol derivatizado con un ácido graso de sorbitán, polietilenglicol derivatizado con diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSPE) , y gangliósido GM1.