Método para potenciar la expresión y acumulación de un polipéptido heterólogo de interés en semillas de plantas,

comprendiendo dicho método:

(a) transformar una célula vegetal con una secuencia de ADN que comprende un promotor específico de semilla operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica para uno o más reguladores de la transcripción (TF), o parte(s) de los mismos, en el que dicho uno o más TF puede(n) ser una combinación quimérica de diferente(s) TF, que regulan la transcripción de uno o más genes endógenos que codifican para proteínas de almacenamiento de semillas, en el que la hebra transcrita de dicha secuencia puede suprimir, retardar o reducir de otra forma la expresión de una o más de dichas proteínas de almacenamiento de semillas en dicha célula vegetal, y

(b) seleccionar un promotor específico de semilla que no tiene elementos que actúan en cis reconocidos por dichos reguladores de la transcripción en (a), y

(c) transformar la misma u otra célula vegetal en (a) con una secuencia de ADN para dicho promotor específico de semilla en (b) operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido heterólogo de interés;

(d) regenerar una planta a partir de dicha(s) célula(s) huésped vegetal(es) transformada(s), y hacer crecer dicha planta en condiciones en las que dicha(s) secuencia(s) de ADN que codifican para uno o más TF, o parte(s) de los mismos, se transcribe, reduciendo de ese modo la expresión de dicho ARNm endógeno, reduciendo así la expresión de dichas proteínas de almacenamiento de semillas, y potenciando así la expresión y acumulación de dicho polipéptido heterólogo de interés.

Potenciación de la acumulación de polipéptidos heterólogos en semillas de plantas a través de supresión dirigida de proteínas de almacenamiento endógenas

Campo de la invención

La presente invención está en el campo de la biología molecular vegetal y se refiere específicamente a los métodos para aumentar la expresión de proteínas heterólogas en semillas de plantas suprimiendo la competencia de expresión endógena de las proteínas de almacenamiento de semillas en el endospermo de plantas monocotiledóneas.

Antecedentes

Muchas plantas expresan y almacenan en el endospermo de semillas en desarrollo una gran reserva de proteínas que sirven para diferentes funciones, tales como diferentes tipos de proteínas de almacenamiento, enzimas metabólicas, endoquitinasas, inhibidores de síntesis de proteínas, inhibidores de proteasa, amilasas, lectinas y peroxidasas. Las proteínas de almacenamiento en el endospermo pueden ascender a más del 15% en peso seco de semilla, tal como es común en muchas especies de cultivos monocotiledóneos. Por consiguiente, en determinado estadio de desarrollo, la maquinaria celular en el endospermo de la semilla está ocupada principalmente con la producción y el almacenamiento de estas proteínas particulares. Además, la mayoría de los genes de proteína de almacenamiento se encuentran en múltiples copias, reflejando la importancia de la rápida acumulación de estas proteínas, en el intervalo de unos días a unas semanas.

La capacidad biológica inherente para la acumulación de proteínas en el endospermo en desarrollo de semillas de cultivo significa que muchas plantas de cultivo, especialmente monocotiledóneas, tienen el potencial para ser un vehículo eficiente y práctico para la producción a gran escala de proteínas recombinantes heterólogas, por ejemplo polipéptidos de alto valor para la industria farmacéutica; un procedimiento de fabricación a menudo denominado agricultura molecular. Además, el almacenamiento de polipéptidos heterólogos en semillas reduce el coste de procesamiento posterior puesto que estas semillas pueden almacenarse durante años sin afectar a la calidad del polipéptido heterólogo. La expresión de tales proteínas está, preferiblemente, bajo el control de promotores específicos de endospermo o específicos de semilla.

Se utilizan estrategias de biología molecular generales, tales como la selección de promotores apropiados y la localización subcelular, cuando se mejoran los niveles de expresión de la proteína heteróloga en la planta particular usada para agricultura molecular, aunque el nivel de expresión también se ve afectado de manera crítica por la naturaleza de la proteína que va a expresarse, su complejidad y función. Sin embargo, los bajos niveles de expresión de la proteína heteróloga (porcentaje bajo de proteína soluble total o %TSP) han sido una preocupación particular, incluso cuando se expresa en semillas. Se requiere un enfoque biotecnológico novedoso para potenciar adicionalmente el nivel de expresión. Esto es un reto considerable, especialmente puesto que el mecanismo celular ya está programado para su papel endógeno que, en semillas en desarrollo, está ocupado preferiblemente con la acumulación de proteínas de almacenamiento y la preparación general para la supervivencia dependiente de la latencia. Los promotores lo más frecuentemente usados para dirigir la expresión del gen heterólogo de interés en el endospermo o en semillas de plantas monocotiledóneas son, en buena parte, promotores de genes de proteína de almacenamiento, tales como el GluB-1, un promotor específico de endospermo del arroz de 1, 3 kb (Patel et al. 2000; número de registro de GeneBank X54314) , o el promotor de D-hordeína de la cebada de 0, 45 kb (Sörensen et al. 1996; número de registro de GeneBank X84368) . Aunque estos promotores son fuertes para dirigir la expresión de proteínas heterólogas de interés, su actividad en tiempo y espacio coinciden con la actividad de promotores endógenos que dirigen las proteínas de almacenamiento más abundantes, provocando la competencia por recursos limitados, tales como aminoácidos, sitios de unión ribosómicos y el conjunto de enzimas que participan en la traducción y el procesamiento postraduccional. Esta competencia afecta negativamente a los niveles de expresión del polipéptido heterólogo de interés.

Sería sumamente deseable tener un método para suprimir la expresión de genes endógenos, tales como muchos de los genes de proteína de almacenamiento endógenos que están compitiendo activamente por recursos, en tiempo y espacio, con la expresión de la proteína heteróloga de interés. Por tanto, la supresión de proteínas de almacenamiento podría tener diversas necesidades industriales si pudiera proporcionarse un método práctico de supresión. Esto puede ser un reto de magnitud considerable en la agricultura molecular, especialmente si el gen endógeno es un miembro de una familia de múltiples genes. En la cebada, por ejemplo, el sumidero principal para recursos en el endospermo son las proteínas de almacenamiento de B-hordeína que pueden representar hasta el 50% de las proteínas del endospermo totales (Shewr y 1993: en Barley; Chemistr y and Technology) .

El término "sumidero" y las expresiones "genes sumidero" ("sink genes") y "proteínas sumidero" ("sink proteins") se refieren en el presente documento a genes y productos génicos que se expresan activamente y absorben una cantidad sustancial de recursos disponibles en la célula, es decir, un sumidero "drena" de una célula una parte sustancial de sus recursos, y por tanto limita los recursos disponibles para la expresión de otros genes y productos génicos.

La tecnología antisentido está surgiendo como un medio eficaz para reducir la expresión de productos génicosendógenos específicos en células vegetales (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.759.829; Ã-rvar et al. 1997; Coles et al. 1999) . Sin embargo, esta tecnología no es un enfoque práctico para suprimir directamente la expresión de genes que son miembros de una familia de genes, que es frecuentemente el caso con las proteínas de almacenamiento de semillas, tales como los genes de B-hordeína que son al menos 20 por genoma haploide (Shewr y et al. 1985) ; la tecnología se adecua mejor a manipular la expresión de genes que no pertenecen a una familia de genes.

Otros método para reducir la expresión de genes endógenos es la aplicación de ARN bicatenario (ARNbc) para el silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) . Este silenciamiento génico inducido por ARN o interferencia por ARN, en el que tanto la hebra de ARN sentido como su hebra antisentido complementaria de un gen endógeno particular se combinan en un ARNbc, se mostró por primera vez en Caenorhabditis elegans (Fire et al. 1998) . Hamilton et al. (1999) indicaron que los ARN con pocos nucleótidos (21-23 nucleótidos de longitud) son productos de degradación del ARNbc que regulan la escisión del ARNm diana endógeno en PTGS en plantas. Un enfoque más potente de silenciamiento génico bicatenario en plantas ha sido el método descrito por Wesley et al. (2001) en el que un gen de silenciamiento génico se construye de tal manera que forma un ARN de "bucle en horquilla" (ARNhp) tras la transcripción. Una forma del silenciamiento génico por ARNhp es el ARNhp sometido a corte y empalme de intrón (ARNihp) en el que el espaciador en el bucle en horquilla es un intrón. El ihpARN puede producir un PTGS muy fuerte en plantas (véase también Waterhouse et al. 2001 y Smith et al. 2000) . Métodos para producir tales constructos de PTGS en un vector especial se describen en la solicitud de patente estadounidense 2003-A-0049835.

El documento EP 1312672 da a conocer una célula vegetal transformada que carece de proteína de almacenamiento de semillas endógena en la que se ha introducido un gen foráneo mediante fertilización cruzada. La descripción hace uso de mutantes que son defectuosos y por tanto no expresan una proteína de almacenamiento de semillas importante, y sugiere, como alternativa a tales mutantes, generar plantas con un nivel reducido de proteína de almacenamiento de semillas mediante supresión conjunta o el método antisentido, es decir posibilitar que se reduzca la supresión directa del gen que codifica para la proteína de almacenamiento.

El documento EP 1327685 da a conocer la identificación y provisión de un factor de transcripción RISBZ1 en arroz, y el uso de dicho factor de transcripción para potenciar la expresión de proteínas de almacenamiento de semillas o una proteína foránea recombinante... [Seguir leyendo]

1. Método para potenciar la expresión y acumulación de un polipéptido heterólogo de interés en semillas de plantas, comprendiendo dicho método:

(a) transformar una célula vegetal con una secuencia de ADN que comprende un promotor específico de semilla operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica para uno o más reguladores de la transcripción (TF) , o parte (s) de los mismos, en el que dicho uno o más TF puede (n) ser una combinación quimérica de diferente (s) TF, que regulan la transcripción de uno o más genes endógenos que codifican para proteínas de almacenamiento de semillas, en el que la hebra transcrita de dicha secuencia puede suprimir, retardar o reducir de otra forma la expresión de una o más de dichas proteínas de almacenamiento de semillas en dicha célula vegetal, y

(b) seleccionar un promotor específico de semilla que no tiene elementos que actúan en cis reconocidos por dichos reguladores de la transcripción en (a) , y

(c) transformar la misma u otra célula vegetal en (a) con una secuencia de ADN para dicho promotor específico de semilla en (b) operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido heterólogo de interés;

(d) regenerar una planta a partir de dicha (s) célula (s) huésped vegetal (es) transformada (s) , y hacer crecer dicha planta en condiciones en las que dicha (s) secuencia (s) de ADN que codifican para uno o más TF, o parte (s) de los mismos, se transcribe, reduciendo de ese modo la expresión de dicho ARNm endógeno, reduciendo así la expresión de dichas proteínas de almacenamiento de semillas, y potenciando así la expresión y acumulación de dicho polipéptido heterólogo de interés.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la hebra transcrita de dicha secuencia que codifica para uno o más reguladores de la transcripción (TF) o parte (s) de los mismos puede (n) formar un ARN "horquilla" que puede suprimir, retardar o reducir de otra forma la expresión de una o más de dichas proteínas de almacenamiento de semillas en dicha célula vegetal.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha célula huésped vegetal se selecciona del grupo de plantas monocotiledóneas.

4. Método según la reivindicación 3, en el que dicha célula huésped vegetal se selecciona del grupo de plantas monocotiledóneas que contiene cebada, maíz, trigo, avena y arroz.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho promotor seleccionado es un promotor de D-hordeína de cebada.

6. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha (s) secuencia (s) de ADN de la etapa (a) y dicha secuencia de ADN de la etapa (b) están operativamente unidas en una secuencia de ADN.

7. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha (s) secuencia (s) de ADN de la etapa (a) y dichas secuencias de ADN de la etapa (b) se introducen en la misma célula vegetal.

8. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha (s) secuencia (s) de ADN de la etapa (a) se introducen en el genoma de una primera célula huésped vegetal, y en el que dicha secuencia de ADN de la etapa (b) se introduce en el genoma de una segunda célula huésped vegetal.

9. Método según la reivindicación 8, en el que una primera planta transgénica se regenera a partir de dicha primera célula huésped vegetal y una segunda planta transgénica se genera a partir de dicha segunda célula huésped vegetal, y en el que una población de la progenie de plantas transgénicas se genera a partir de cruzamiento sexual entre dicha primera y dicha segunda planta transgénica.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha una o más proteína (s) de almacenamiento de semillas es una hordeína de cebada.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para un polipéptido heterólogo de interés codifica para una proteína del grupo de proteínas procariotas o eucariotas.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para un polipéptido heterólogo de interés codifica para una proteína de un organismo termófilo.

13. Método según la reivindicación 11 ó 12, en el que dicha secuencia codifica para un módulo de unión a

hidrato de carbono (CBM) .

14. Método según la reivindicación 11, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para una proteína procariota o eucariota se selecciona del grupo que consiste en secuencias de ADN que codifican para colágenos, colagenasa, polipéptidos de secuencia homeótica, anticuerpos monoclonales, anticuerpos secretados, anticuerpos de cadena sencilla, lectina de unión a manosa, pepsina, quimiotripsina, tripsina, caseína, hormona de crecimiento humana, albúmina sérica humana, insulina humana, celulasas, pectinasas, hemicelulasas, fitasas, hidrolasas, peroxidasas, fibrinógeno, factor IX, factor XIII, trombina, proteína C, xilanasa, isoamilasa, glucoamilasa, amilasa, lisozima, beta-glucanasa glucocerebrosidasa, caseínas, lactasa, ureasa, glucosa isomerasa, invertasa, estreptavidina, esterasas, fosfatasa alcalina, inhibidores de proteasa, papaína, cinasas, fosfatasas, desoxirribonucleasas, ribonucleasas, fosfolipasas, lipasas, lacasa, proteínas de seda de araña, proteínas anticongelantes, defensinas o péptidos antimicrobianos, factores de crecimiento y citocininas.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para una proteína eucariota es un gen B4 de secuencia homeótica (HoxB4) humano que codifica para una proteína HoxB4.

16. Método según la reivindicación 15, en el que dicha proteína HoxB4 tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para uno o más TF es una secuencia de ADN quimérica que comprende regiones de dos o más secuencias de ADN que codifican para los TF, o partes de los mismos.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para un TF o parte del mismo comprende una región que codifica para un TF o parte del mismo del grupo de las proteínas bZIP.

19. Método según la reivindicación 18, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para una proteína BZIP comprende una secuencia de ADN seleccionada de

a) una secuencia de ADN que codifica para la proteína BLZ1 de cebada o una parte de la misma:

b) una secuencia de ADN que codifica para la proteína BLZ2 de cebada o una parte de la misma;

c) una combinación de a) y b) .

20. Método según la reivindicación 19, en el que dicha secuencia de ADN se selecciona de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y cualquier parte o combinación de las mismas.

21. Método según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para TF puede expresar un ARN horquilla (ARNhp) en dicha célula vegetal.

22. Método según la reivindicación 21, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para TF comprende una región o parte de la misma que codifica para un TF del grupo de las proteínas bZIP.

23. Método según la reivindicación 22, en el que dicha proteína bZIP se selecciona de BLZ1, BLZ2 y una combinación quimérica de BLZ1 y BLZ2.

24. Método según la reivindicación 23, en el que dicha secuencia de ADN comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y cualquier parte o combinación de las mismas.

25. Planta de cebada transgénica que se transforma con:

a) una secuencia de ADN que comprende un promotor específico de semilla operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica para uno o más reguladores de la transcripción (TF) , o parte (s) de los mismos, que incluye una combinación quimérica de diferente (s) TF, que regulan la transcipción de uno o más genes endógenos que codifican para proteínas de almacenamiento de semillas, b) un promotor específico de semilla que no tiene elementos que actúan en cis reconocidos por dichos reguladores de la transcripción operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica para una proteína heteróloga de interés, expresando dicha planta en sus semillas dicha proteína heteróloga y expresando sustancialmente menos proteína de almacenamiento de semillas que una planta no recombinante correspondiente.