Anticuerpo antagonista anti-VEGF-E para utilizar en un procedimiento de tratamiento del cáncer en un mamíferomediante la administración en serie o en combinación con un segundo agente,

ya bien sea en la misma composicióno en composiciones separadas, donde VEGF-E es el polipéptido VEGF-E de secuencia nativa de longitud completaque comprende los aminoácidos 1 a 345 tal como se ilustran en la Figura 2 o una de sus formas truncada osecretada de origen natural o alternativamente procesada o alélica de la misma, y donde el anticuerpo antagoniza una o más de las siguientes actividades del VEGF-E:

(i) estimulación del crecimiento selectivo y/o la supervivencia de las células endoteliales de lavena umbilical humana;

(ii) inducción del gen c-fos temprano inmediato en las líneas celulares endoteliales humanas;

(iii) inducción de la hipertrofia de los miocitos en las células cardiacas; o

(iv) inhibición de la proliferación estimulada por VEGF de las células endoteliales capilarescorticales adrenales.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos relacionados con el factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (en lo sucesivo ocasionalmente denominado VEGF) y proteína morfogenética ósea 1 (en lo sucesivo ocasionalmente denominada BMP1) , denominados en la presente invención polipéptidos VEGF-E, ácidos nucleicos codificantes de los mismos, procedimientos para preparar VEGF-E y procedimientos, composiciones y ensayos que utilizan VEGF-E.

Antecedentes de la invención

Diversos polipéptidos de origen natural se ha informado de que inducen la proliferación de células endoteliales. Entre estos polipéptidos se encuentran los factores de crecimiento fibroblástico (FGF) básicos y ácidos (Burgess y Maciag, Annual Rev. Biochem. 58:575, 1989) , factor de crecimiento de células endoteliales derivadas de plaquetas (PD-ECGF) (Ishikawa et al., Nature 338:557, 1989) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Leung et al., Science 246:1306, 1989; Ferrara y Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161:851, 1989; Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165:1198, 1989; patente EP nº 471.754B concedida el 31 de julio de 1996.

El factor de crecimiento de células endoteliales ligante de heparina, VEGF, se identificó y se purificó a partir de medio condicionado con células foliculares pituitarias bovinas o folículo-estrelladas hace varios años (ver Ferrara et al., Biophys. Res. Comm. 161:851, 1989) . Los medios condicionados por células transfectadas con ADNc de VEGF humano (VEGFh) estimularon la proliferación de células endoteliales capilares, mientras que las células de control no presentaron este efecto (Leung et al., Science 246:1306, 1989) . VEGF es un compuesto de origen natural producido en las células foliculares o folículo-estrelladas (FC) , una población morfológicamente bien caracterizada de células granulares. Las FC son células estrelladas que envían procesos citoplasmáticos entre células secretorias.

VEGF se expresa en una diversidad de tejidos en forma de múltiples isoformas homodiméricas (121, 165, 189 y 206 aminoácidos por monómero) , también denominadas colectivamente proteínas de tipo VEGFh, resultantes del procesamiento alternativo del ARN. La proteína de 121 aminoácidos diferente de VEGFh por la deleción de los 44 aminoácidos entre los residuos 116 y 159 en VEGFh. La proteína de 189 aminoácidos difiere de VEGFh por la inserción de 24 aminoácidos en el residuo 116 en VEGFh y aparentemente es idéntica al factor de permeabilidad vascular humano (VPFh) . La proteína de 206 aminoácidos difiere de VEGFh por la inserción de 41 aminoácidos en el residuo 116 en VEGFh (Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806, 1991; Ferrara et al., J. Cell. Biohcem. 47:211, 1991; Ferrara et al., Endocrine Reviews 13:18, 1992; Keck et al., Science 246:1309, 1989; Connolly et al., J. Biol. Chem. 264:20017, 1989; patente EP nº 370.989, publicada el 30 de mayo de 1990. VEGF121 es un mitógeno soluble que no se une a heparina; las formas más largas de VEGF se unen a la heparina con afinidad progresivamente más elevada. Las formas ligantes de heparina de VEGF pueden ser cortadas en el péptido carboxi-terminal por la plasmina, liberando: (a) una o más formas difusibles de VEGF. La secuencia de aminoácidos del péptido carboxiterminal identificado tras el corte con plasmina es Arg110-Ala111. La proteína “nuclear” aminoterminal, VEGF (1110) , aislada en forma de homodímero, se une a anticuerpos monoclonales neutralizantes (4.6.1 y 2E3) y a formas solubles de tirosina quinasa de tipo FMS (FLT-1) , a receptores de región de dominio quinasa (KDR) y de quinasa hepática fetal (FLK) con afinidad similar al homodímero VEGF165 intacto.

Tal como se ha indicado, VEGF contiene dos dominios responsables, respectivamente, de la unión a los receptores KDF y FLT-1. Estos receptores únicamente existen sobre las células endoteliales (vasculares) . A media que las células agotan el oxígeno, debido a traumatismos y similares, se incrementa la producción de VEGF en estas células, que después se unen a los receptores respectivos con el fin de señalizar un efecto biológico final. Seguidamente, la señal incrementa la permeabilidad vascular y las células se dividen y se expanden formando nuevas rutas vasculares: vasculogénesis y angiogénesis.

De esta manera, VEGF resulta útil para tratar condiciones en las que resulta importante una acción seleccionada sobre las células endoteliales vasculares, en ausencia de crecimiento excesivo de tejido, por ejemplo en úlceras diabéticas y en lesiones vasculares resultantes de traumatismo, tales como las heridas subcutáneas. Al ser un factor de crecimiento celular endotelial vascular (arterial y venoso) , VEGF restaura las células dañadas, un proceso denominado vasculogénesis, y estimular la formación de nuevos vasos, un proceso denominado angiogénesis.

VEGF también resultaría útil en la restauración de la vasculatura tras un infarto de miocardio, así como en otros usos que pueden deducirse. A este respecto, en ocasiones resultan deseables los inhibidores del VEGF, particularmente para mitigar procesos tales como la angiogénesis y la vasculogénesis en células cancerosas.

En la actualidad está bien establecido que la angiogénesis, que implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de endotelio preexistente, se encuentra implicado en la patogénesis de una diversidad de trastornos. Entre estos se incluyen tumores sólidos y metástasis, aterosclerosis, fibroplasia retrolenta, hemangiomas, inflamación crónica, síndromes neovasculares intraoculares, tales como retinopatías proliferativas, por ejemplo la retinopatía diabética, la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) , el glaucoma neovascular, el rechazo inmunológico del tejido corneal trasplantado y de otros tejidos, la artritis reumatoide y la soriasis (Folkman et al., J.

Biol. Chem. 267:10931-10934, 1992; Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239, 1991, y Garner A., “Vascular diseases”, en: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, editores, 2a edición (Marcel Dekker, NY, 1994) , páginas 1625 a 1710.

En el caso del crecimiento tumoral, la angiogénesis aparentemente resulta crucial para la transición de la hiperplasia a la neoplasia, y para proporcionar alimento al tumor sólido en crecimiento (Folkman et al., Nature 339:58, 1989) . La neovascularización permite que las células tumorales adquieran una ventaja de crecimiento y de autonomía proliferativa sobre las células normales. Por consiguiente, se ha observado una correlación entre la densidad de microvasos en secciones de tumor y la supervivencia del paciente en el cáncer de mama, así como en varios otros tumores (Weidner et al., N. Engl. J. Med. 324:1-6, 1991; Horak et al., Lancet 340:1120-1124, 1992; Macchiarini et al., Lancet 340:145-146, 1992) .

La búsqueda de reguladores positivos de la angiogénesis ha proporcionado muchos candidatos, incluyendo FGFa, FGFb, TGF-a, TGF-º, HGF, TNF-a, angiogenina, IL-8, etc. (Folkman et al., J.B.C., supra, y Klagsbrun et al., supra) . Entre los reguladores negativos identificados hasta el momento se incluyen la trombospondina (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6624-6628, 1990) , el fragmento N-terminal de 16 kilodaltons de la prolactina (Clapp et al., Endocrinology 133:1292-1299, 1993) , la angiostatina (O’Reilly et al., Cell 79:315-328, 1994) y la endostatina (O’Reilly et al, Cell 88:277-285, 1996) . Los trabajos realizados en los últimos años han establecido el papel clave del VEGF, no sólo en la estimulación del a proliferación de células endoteliales vasculares, sino también en la inducción de la permeabilidad vascular y la angiogénesis (Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25, 1997) . El resultado de que la pérdida de incluso un sólo alelo de VEGF resulta en letalidad embrionaria apunta a un papel irremplazable de este factor en el desarrollo y la diferenciación del sistema vascular. Además, se ha demostrado que VEGF es un mediador clave en la neovascularización asociada a tumores y a trastornos intraoculares (Ferrar et al., Endocr. Rev., supra) . El ARNm de VEGF se sobreexpresa en la mayoría de los tumores humanos examinados (Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-159, 1993; Brown et al., Human Pathol. 26:86-91, 1995; Brown et al., Cancer Res. 53:47274735, 1993; Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-934, 1996; Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-1039, 1995) .

Además, las concentraciones de VEGF en los líquidos oculares... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo antagonista anti-VEGF-E para utilizar en un procedimiento de tratamiento del cáncer en un mamífero mediante la administración en serie o en combinación con un segundo agente, ya bien sea en la misma composición

o en composiciones separadas, donde VEGF-E es el polipéptido VEGF-E de secuencia nativa de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 345 tal como se ilustran en la Figura 2 o una de sus formas truncada o secretada de origen natural o alternativamente procesada o alélica de la misma, y donde el anticuerpo antagoniza una o más de las siguientes actividades del VEGF-E:

(i) estimulación del crecimiento selectivo y/o la supervivencia de las células endoteliales de la vena umbilical humana;

(ii) inducción del gen c-fos temprano inmediato en las líneas celulares endoteliales humanas;

(iii) inducción de la hipertrofia de los miocitos en las células cardiacas; o

(iv) inhibición de la proliferación estimulada por VEGF de las células endoteliales capilares corticales adrenales.

2. Anticuerpo anti-VEGF-E según la reivindicación 1, donde el segundo agente es un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, un agente citotóxico, un agente angiostático, un agente utilizado en radioterapia o un anticuerpo anti-VEGF.

3. Anticuerpo anti-VEGF-E según la reivindicación 2, donde el segundo agente es un agente angiostático.

4. Anticuerpo anti-VEGF-E según la reivindicación 3, donde el agente angiostático es un anticuerpo anti-VEGF.

5. Anticuerpo anti-VEGF-E según la reivindicación 1, donde el segundo agente es un antagonista FGF o un antagonista PDGF o un anticuerpo que se une a un receptor ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 o VEGF.

6. Anticuerpo anti-VEGF-E según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo anti-VEGF-E humanizado.

7. Anticuerpo anti-VEGF-E según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el mamífero es humano.

8. Anticuerpo anti-VEGF-E según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la actividad de:

(i) estimular la supervivencia de las células endoteliales de la vena umbilical humana; o

(ii) inducir la hipertrofia de los miocitos en las células cardiacas;

se analiza utilizando una proteína de fusión VEGF-E-IgG codificada por una construcción de ácidos nucleicos que comprende el marco de lectura abierto para el VEGF-E contenido en la secuencia de la Fig. 1 frente al ácido nucleico codificante de la Fc de una IgG humana.

9. Anticuerpo anti-VEGF-E según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la actividad de inhibición de la proliferación estimulada por VEGF de las células endoteliales capilares corticales adrenales se analiza utilizando una proteína de fusión VEGF-E-His8 codificada por una construcción de ácidos nucleicos que comprende un marco de lectura abierto para VEGF-E contenido en la secuencia de la Fig.1 frente el ácido nucleico condificante del marcador His8.

10. Utilización de un anticuerpo antagonista anti-VEGF-E para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en un mamífero, donde el anticuerpo y el tratamiento son tal como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Agente seleccionado a partir de un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, un agente citotóxico, un agente angiostático, un agente utilizado en radioterapia, un anticuerpo anti-VEGF, un antagonista FGF, un antagonista PDFG o un anticuerpo que se une a un receptor ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 o VEGF para utilizar en un procedimiento destinado al tratamiento del cáncer en un mamífero mediante la administración en serie o en combinación con un anticuerpo antagonista anti-VEGF-E tal como se define en la reivindicación 1, ya bien sea en la misma composición o en composiciones separadas.

12. Agente según la reivindicación 11, donde el anticuerpo anti-VEGF-E es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6, 8 y 9.

13. Agente según la reivindicación 11 ó 12, que es tal como se define en la reivindicación 3 o la reivindicación 4.

14. Agente según la reivindicación 13, donde el mamífero es humano.

15. Utilización de un agente seleccionado a partir de un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del

crecimiento, un agente citotóxico, un agente angiostático, un agente utilizado en radioterapia, un anticuerpo anti-VEGF, un antagonista FGF, un antagonista PDFG o un anticuerpo que se une a un receptor ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 o VEGF para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en un mamífero, donde el agente y el tratamiento son tal como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 11-14.