Polipéptidos con actividad de aumento celulolítica y polinucleótidos que los codifican.

Polipéptido aislado con actividad de aumento celulolítica, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con los aminoácidos 23 a250 de 5 la SEC ID nº: 2 y

(b) un polipéptido que es codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo al menos condiciones de astringencia altascon (i) los nucleótidos 67 a 796 de la SEC ID nº: 1, (ii) la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 67 a 796 de laSEC ID nº: 1, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii).

Polipéptidos con actividad de aumento celulolítica y polinucleótidos que los codifican

Antecedentes de la invención Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad de aumento celulolítica y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células huésped comprendiendo los polinucleótidos al igual que métodos para producir y usar los polipéptidos.

Descripción de las técnicas relacionadas [0002] La celulosa es un polímero de la glucosa de azúcar simple unida de manera covalente por enlaces beta-1, 4. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan glucanos beta-unidos. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasas y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas digieren los polímeros de celulosa en lugares al azar, abriéndolas para atacar con celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas liberan secuencialmente moléculas de celobiosa de los extremos del polímero de celulosa. La celobiosa es un dímero hidrosoluble beta-1, 4-unido de glucosa. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa a glucosa. Estas enzimas han sido clonadas y expresadas de manera recombinante (Saloheimo et al. Eur.J. Biochem. 249, 584-591 (1997) ) .

La conversión de materias primas celulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad rápida de grandes cantidades de materia prima, la conveniencia de evitar la quema o el llenado de tierra de los materiales y la limpieza del combustible de etanol. Madera, residuos agrícolas, cultivos herbáceos y desperdicios sólidos municipales han sido considerados como materias primas para producción de etanol. Estos materiales principalmente consisten en celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez la celulosa se convierte a glucosa, la glucosa es fermentada fácilmente por levadura en etanol.

Sería ventajoso en la técnica para mejorar la conversión de materias primas celulósicas.

Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos aislados con actividad de aumento celulolítica y secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos para mejorar la conversión de materias primas celulósicas.

Resumen de la invención [0006] La presente invención se refiere en un primer aspecto a polipéptido aislado con actividad de aumento celulolítica, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con los aminoácidos 23 a 250 de la SEC ID nº: 2 y

(b) un polipéptido que es codificado por un polinucleótido que hibrida bajo al menos condiciones de astringencia altas con (i) los nucleótidos 67 a 796 de la SEC ID nº: 1, (ii) la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 67 a 796 de la SEC ID nº: 1, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii) .

La presente invención también se refiere en un segundo aspecto a polinucleótidos aislados comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del primer aspecto, al igual que a una planta, parte de planta o célula vegetal, que ha sido transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido del primer aspecto.

La presente invención también se refiere en unos terceros aspectos a una construcción de ácidos nucleicos comprendiendo el polinucleótido del segundo aspecto operativamente unido a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en una célula huésped, esta célula huésped es una célula huésped no humana.

La invención también se refiere a un vector de expresión recombinante comprendiendo la construcción de ácidos nucleicos del tercer aspecto, a una célula huésped recombinante no humana comprendiendo la construcción de ácidos nucleicos del tercer aspecto.

La invención también se refiere a un método para la producción del polipéptido del primer aspecto comprendiendo: (a) cultivo de una célula huésped no humana comprendiendo una construcción de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

La invención también se refiere a un método para la producción del polipéptido del primer aspecto, comprendiendo: (a) cultivo de una planta transgénica o una célula de planta transgénica que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido con actividad de aumento celulolítica bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

Finalmente la invención también se refiere a un método para degradación o conversión de un material celulósico, comprendiendo: tratamiento del material celulósico con una cantidad eficaz de una proteína celulolítica en presencia de una cantidad eficaz del polipéptido con actividad de aumento celulolítica del primer aspecto, donde la presencia del

polipéptido con actividad de aumento celulolítica aumenta la degradación de material celulósico en comparación con la ausencia del polipéptido con actividad de aumento celulolítica.

Breve descripción de las figuras [0013] La Figura 1 muestra la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de una actividad de aumento celulolítica de Termoascu aurantiacus (SEC ID nº: 1 y 2, respectivamente) . Intrones predichos están en cursiva. El péptido señal (SignalP) previsto está subrayado. La secuencia codificante es 799 pares de bases que incluye el codón de terminación y se interrumpe por un intrón de 56 pares de bases. El polipéptido maduro previsto contiene 228 aminoácidos. La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pAILo1. La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pBANe10. La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pAILo2. La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pDZA2.

Definiciones [0014] Actividad de aumento celulolítica: el término "actividad de aumento celulítica" es definida aquí como una actividad biológica que mejora la hidrólisis de un material celulósico por proteínas con actividad celulolítica. Para fines de la presente invención, actividad de aumento celulolítica se determina por medición del aumento en azúcares reductores a partir de la hidrólisis de un material celulósico con proteína celulolítica bajo las siguientes condiciones: 5, 0 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS durante 5-7 días a 50°C en presencia y ausencia de 0, 01-2, 5 mg de actividad de aumento celulolítica por g de celulosa en PCS en comparación con una hidrólisis de control con la misma de carga de proteína total sin actividad de aumento celulolítica (5, 01-7, 5 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS) . En un aspecto preferido, una preparación con celulasa derivada de fermentación de Trichoderma reesei expresando una betaglucosidasa de Aspergillus or y zae (WO 02/095014) , de ahora en adelante llamada Tr/AoBG y obtenida de Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca, de carga de proteína de celulasa se usa como la fuente de la actividad celulolítica.

Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos 20%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de forma más preferida al menos 95%, e incluso de forma más preferida al menos 100% de la actividad de aumento celulolítica del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 23 a 250 de la SEC ID nº: 2.

Material celulósico: el término "material celulósico" es definido aquí como cualquier material con celulosa. La celulosa se encuentra generalmente, por ejemplo, en los tallos, hojas, vainas, cáscaras y mazorcas de plantas u hojas, ramas y madera de árboles. El material celulósico puede también ser, pero no está limitado a, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos de silvicultura, desperdicios sólidos municipales, papel usado y pulpa y residuos de fábrica de papel. Se entiende aquí que la celulosa puede estar en forma de lignocelulosa, un material de pared celular vegetal con lignina, celulosa y hemicelulosa en una matriz mezclada.

En un aspecto preferido, el material celulósico es restos de maíz. En otro aspecto preferido, el... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado con actividad de aumento celulolítica, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con los aminoácidos 23 a 5 250 de la SEC ID nº: 2 y

(b) un polipéptido que es codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo al menos condiciones de astringencia altas con (i) los nucleótidos 67 a 796 de la SEC ID nº: 1, (ii) la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 67 a 796 de la SEC ID nº: 1, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii) .

10 2. Polipéptido según la reivindicación 1, con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o incluso al menos 97% de identidad con los aminoácidos 23 a 250 de la SEC ID nº: 2.

3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID

nº: 2. 15

4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que consiste en la SEC ID nº: 2 o un fragmento de esta teniendo actividad de aumento celulolítica.

5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que consiste en los aminoácidos 23 a 250 de la SEC ID nº:

20 2.

6. Polinucleótido aislado comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según la reivindicación 1.

25 7. Construcción de ácidos nucleicos comprendiendo el polinucleótido según la reivindicación 6 operativamente unido a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en una célula huésped fúngica.

8. Vector de expresión recombinante comprendiendo la construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 7.

30 9. Célula huésped recombinante fúngica comprendiendo la construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 7.

10. Método para la producción del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 comprendiendo: (a) cultivo de una célula huésped fúngica comprendiendo una construcción de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación

del polipéptido.

11. Método para la producción del polipéptido según cualquiera de reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo: (a) cultivo de una planta transgénica o una célula de planta transgénica comprendiendo un polinucleótido que codifica el polipéptido con actividad de aumento celulolítica bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación

del polipéptido.

12. Planta transgénica, parte de planta o célula vegetal, que ha sido transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

45 13. Método para degradación o conversión de un material celulósico, comprendiendo: tratamiento del material celulósico con una cantidad eficaz de una proteína celulolítica en presencia de una cantidad eficaz del polipéptido con actividad de aumento celulolítica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la presencia del polipéptido con actividad de aumento celulolítica aumenta la degradación del material celulósico en comparación con la ausencia del polipéptido con actividad de aumento celulolítica.

14. Método según la reivindicación 13, donde el método es un paso en un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF) .

15. Método según la reivindicación 13, donde el método es un paso de un proceso híbrido de hidrólisis y fermentación 55 (HHF) .