Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima quemodifica un compuesto isoprenoide,

en que la secuencia nucleotídica codifica un polipéptido que tiene al menos el85 % de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica expuesta en SEQ ID NO: 2, en que elpolipéptido muestra actividad de amorfa-4,11-dieno-oxidasa.

Polinucleótidos que codifican enzimas modificadoras de isoprenoides y procedimientos de uso de los mismos

REFERENCIA RECÍPROCA

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de los EE. UU. n° 60/697.067, presentada el 5 de julio de 2005.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención corresponde al campo de la producción de compuestos isoprenoides y, en particular, de las enzimas que modifican compuestos isoprenoides.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los isoprenoides constituyen un grupo extremadamente amplio y diverso de productos naturales que tienen un origen biosintético común, es decir, un único precursor metabólico, isopentenildifosfato (IPP) . Se han descrito al menos 20.000 isoprenoides. Por definición, los isoprenoides están compuestos por, así denominadas, unidades de isopreno (C5) . Típicamente, el número de átomos de C presentes en los isoprenoides es divisible por cinco (C5, C10, C15, C25, C30 y C40) , aunque se han descrito isoprenoides y politerpenos irregulares. Los compuestos isoprenoides también se denominan “terpenos” o “terpenoides”. Algunos miembros importantes de los isoprenoides incluyen los carotenoides, sesquiterpenoides, diterpenoides y hemiterpenos. Los carotenoides incluyen,

p. ej., licopeno, º-caroteno y similares, muchos de los cuales funcionan como antioxidantes. Los sesquiterpenoides incluyen, p. ej., artemisinina, un compuesto con actividad contra la malaria. Los diterpenoides incluyen, p. ej., taxol, un agente quimioterapéutico contra el cáncer.

Los isoprenoides comprenden la familia más numerosa y estructuralmente diversa de productos naturales. En esta familia, los terpenoides aislados de plantas y de otras fuentes naturales se usan como compuestos saborizantes y aromáticos comerciales y también como compuestos farmacéuticos, como fármacos contra la malaria, los virus o el cáncer. La mayoría de los compuestos terpenoides en uso en la actualidad son productos naturales o derivados de estos. Los organismos de origen (p. ej., árboles, invertebrados marinos) de muchos de estos productos naturales no son aptos para el cultivo a gran escala necesario para producir cantidades comercialmente viables ni para la manipulación genética para aumentar la producción o para la derivatización de estos compuestos. Por lo tanto, los productos naturales deben producirse de manera semisintética a partir de análogos o sintéticamente por medio de síntesis químicas convencionales. Además, muchos productos naturales tienen estructuras complejas y, como resultado, su síntesis no resulta económica o es imposible en la actualidad. Tales productos naturales deben extraerse de sus fuentes nativas, como árboles, esponjas, corales y microbios marinos o producirse de manera sintética o semisintética a partir de precursores más abundantes. La extracción de un producto natural de una fuente nativa está limitada por la disponibilidad de la fuente nativa y la producción sintética o semisintética de productos naturales puede adolecer de bajo rendimiento y/o altos costes. Estos problemas de producción y la limitada disponibilidad de la fuente natural pueden restringir el desarrollo comercial y clínico de tales productos.

Un ejemplo de un compuesto sesquiterpénico importante es la artemisinina. La artemisinina es un fármaco muy efectivo contra la malaria que actualmente se extrae de plantas (Artemisia annua) y se usa en medicamentos para tratamientos combinados. La artemisinina de origen vegetal es costosa y su disponibilidad está sujeta a las condiciones climáticas y políticas en los países que cultivan las plantas. El ácido artemisínico es un intermedio clave en la biosíntesis de la artemisinina. La conversión de amoría-4, 11-dieno en alcohol artemisínico, una etapa importante en la producción de artemisinina, mediante química tradicional es un proceso difícil y costoso.

En la técnica existe la necesidad de procedimientos para la generación de compuestos isoprenoides que eviten algunos de los inconvenientes mencionados. La presente invención aborda esta necesidad al proporcionar polinucleótidos que codifican enzimas que modifican compuestos isoprenoides y células huésped modificadas genéticamente para la producción de tales enzimas.

Bibliografía

Bertea y col. (2005) Planta Med. 71: 40 – 47; deKraker y col. (2003) Tetrahedron 59: 409 – 418; Martin y col. (2003) Nat. Biotechnol. 21: 796 – 802; documento WO 03/025193; publicación de patente de los EE. UU. n° 20050019882; publicación de patente de los EE. UU. n° 20030148479; publicación de patente de los EE. UU. n° 20040005678; publicación de patente de los EE. UU. n° 20030166255.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican enzimas modificadoras de isoprenoides con actividad de amoría-4, 11-dieno-oxidasa, según se definen en las reivindicaciones adjuntas, así como vectores recombinantes que comprenden los ácidos nucleicos según se definen en las reivindicaciones adjuntas. Además, la presente invención proporciona células huésped modificadas genéticamente con un ácido nucleico o un vector recombinante objeto según se definen en las reivindicaciones adjuntas. Además, la presente invención proporciona una planta transgénica modificada genéticamente con un ácido nucleico objeto según se define en las reivindicaciones adjuntas. Además, la presente invención proporciona procedimientos para la producción de un compuesto isoprenoide, en que el procedimiento implica generalmente el cultivo de una célula huésped modificada genéticamente objeto en condiciones que permiten la síntesis de una enzima con actividad de amoría-4, 11-dieno-oxidasa por un ácido nucleico objeto, en que la enzima modifica un compuesto isoprenoide, según se define en las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

reductasa de Artemisia annua (SEQ ID NO: 3) .

La figura 4 muestra la secuencia aminoacídica de una citocromo-P450-reductasa de Artemisia annua. (SEQ ID NO: 4) . [0013] Las figuras 5A – C muestran los resultados de un experimento de suministro de sustrato in vivo. [0014] Las figuras 6A y 6B muestran la confirmación del producto por CG-EM. [0015] Las figuras 7A – C muestran la producción de novo de ácido artemisínico en levaduras. [0016] Las figuras 8A – C muestran ensayos enzimáticos in vitro para la amoríadieno-oxidasa. [0017] La figura 9 muestra la secuencia nucleotídica de un ADNc (clon 71D – B1) que codifica una enzima

modificadora de isoprenoides (SEQ ID NO: 5) .

La figura 10 muestra la secuencia aminoacídica de una enzima modificadora de isoprenoides (71D – B1; SEQ ID NO: 6) . [0019] Las figuras 11A – C muestran la actividad de hidroxilación de la enzima 71D – B1. [0020] La figura 12 muestra la secuencia nucleotídica de un ADN genómico que codifica una enzima

modificadora de isoprenoides (SEQ ID NO: 7) . [0021] La figura 13 es una representación esquemática de las rutas metabólicas de los isoprenoides que resultan en la producción de los poliprenildifosfatos intermedios de la ruta biosintética de los isoprenoides,

geranildifosfato (GPP) , farnesildifosfato (FPP) y geranilgeranildifosfato (GGPPP) , a partir de isopentenildifosfato (IPP) y dimetilalildifosfato (DMAPP) . [0022] La figura 14 es una representación esquemática de la ruta del mevalonato (MEV) para la producción de

IPP. [0023] La figura 15 es una representación esquemática de la ruta de la DXP para la producción de IPP y dimetilalilpirofosfato (DMAPP) .

DEFINICIONES

Los términos “isoprenoide”, “compuesto isoprenoide”, “terpeno”, “compuesto terpénico”, “terpenoide” y “compuesto terpenoide” se usan de manera intercambiable en este documento. Los compuestos isoprenoides están formados por un número variable de, así denominadas, unidades de isopreno (C5) . Típicamente, el número... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima que modifica un compuesto isoprenoide, en que la secuencia nucleotídica codifica un polipéptido que tiene al menos el 85 % de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica expuesta en SEQ ID NO: 2, en que el polipéptido muestra actividad de amoría-4, 11-dieno-oxidasa

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en que la secuencia nucleotídica tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia nucleotídica con la secuencia nucleotídica expuesta en SEQ ID NO: 1.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1, en que el polinucleótido comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica expuesta en SEQ ID NO: 2.

4. El polinucleótido de la reivindicación 3, en que la secuencia nucleotídica codifica un polipéptido que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica expuesta en SEQ ID NO: 2.

5. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que opcionalmente dicho polinucleótido está ligado operativamente a un promotor.

6. Una célula huésped modificada genéticamente con el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el vector de la reivindicación 5.

7. La célula huésped de la reivindicación 6, que se selecciona del grupo que consta de una célula procariota, una célula de levadura y una célula vegetal.

8. Un procedimiento para la producción de un compuesto isoprenoide en una célula huésped, en que dicho procedimiento comprende: el cultivo de una célula huésped modificada genéticamente de las reivindicaciones 6 ó 7 en un medio adecuado para producir una enzima modificadora de isoprenoides, en que, en presencia de un sustrato terpénico, dicha producción de dicha enzima modificadora de isoprenoides resulta en la modificación enzimática del sustrato terpénico y la producción del compuesto isoprenoide; y en que dicha enzima modificadora de isoprenoides es una amoríadieno-oxidasa y en que el sustrato terpénico es amoría-4, 11-dieno.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en que dicha célula huésped se modifica genéticamente además con un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una terpeno-sintasa, en que dicho cultivo da lugar a la producción de dicha terpeno-sintasa, en que dicha terpeno-sintasa se selecciona de una terpeno sintasa que modifica un farnesilpirofosfato para generar un sustrato sesquiterpénico para dicha enzima modificadora de isoprenoides.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en que dicha célula huésped es una célula que no sintetiza normalmente isopentenilpirofosfato (IPP) por la ruta del mevalonato y en que la célula huésped se modifica genéticamente con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican dos o más enzimas de la ruta del mevalonato, una IPP-isomerasa, una prenil-transferasa y una terpeno-sintasa, en que dicho cultivo da lugar a la producción de las enzimas de la ruta del mevalonato, en que dicha producción de dichas dos o más enzimas de la ruta del mevalonato, dicha IPP-isomerasa, dicha prenil-transferasa, dicha terpeno-sintasa y dicha enzima modificadora de isoprenoides, resulta en la producción de un compuesto isoprenoide.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en que dichas dos o más enzimas de la ruta del mevalonato comprenden mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa y mevalonato-pirofosfato-descarboxilasa y en que la célula huésped se cultiva en presencia de mevalonato.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, en que dichas dos o más enzimas de la ruta del mevalonato comprenden acetoacetil-CoA-tiolasa, hidroximetilglutaril-CoA-sintasa, hidroximetilglutaril-CoA-reductasa, mevalonato-cinasa, fosfomevalonato-cinasa y mevalonato-pirofosfato-descarboxilasa.

13. El procedimiento de la reivindicación 10, en que dicha prenil-transferasa es una farnesilpirofosfatosintasa.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en que dicha célula huésped se modifica genéticamente con un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una citocromo-P450-reductasa, en que la reductasa transfiere electrones desde NADPH a una enzima modificadora de isoprenoides.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en que dicho ácido nucleico tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia nucleotídica con la secuencia nucleotídica expuesta en SEQ ID NO: 3.

16. El procedimiento de la reivindicación 8, en que la célula huésped es una célula procariota, en que dicha célula es una célula que normalmente sintetiza isopentenildifosfato a través de la ruta de la 1-desoxi-Dxilulosa-5-fosfato.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en que la ruta de la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato se inactiva.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17, que comprende además el aislamiento del compuesto isoprenoide.

19. El procedimiento de la reivindicación 9, en que el compuesto isoprenoide es ácido artemisínico y dicho procedimiento comprende además la modificación del ácido artemisínico para generar artemisinina y el aislamiento de dicha artemisinina.

20. Una planta transgénica modificada genéticamente con un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima modificadora de isoprenoides, en que la secuencia nucleotídica codifica un polipéptido que tiene al menos el 85 % de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica expuesta en SEQ ID NO: 2, en que el polipéptido muestra actividad de amoría-4, 11-dieno-oxidasa y en que el ácido nucleico se expresa en una célula de la planta para producir la enzima modificadora de isoprenoides en la célula.

21. La planta transgénica de la reivindicación 20, en que la planta es tabaco o Artemisia annua.

22. La planta transgénica de las reivindicaciones 20 ó 21, en que la secuencia nucleotídica que codifica la enzima modificadora de isoprenoides está ligada operativamente a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de un tejido.

23. La planta transgénica de la reivindicación 22, en que el promotor específico de un tejido es un promotor específico de tricomas.

24. Un procedimiento para la producción de un compuesto isoprenoide, en que el procedimiento comprende el mantenimiento de la planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en que la enzima modificadora de isoprenoides se produce en dicha planta transgénica y en que la producción de la enzima modificadora de isoprenoides resulta en la modificación de un sustrato terpénico y la producción de un compuesto isoprenoide.