PLANTAS Y HONGOS TRANSGÉNICOS CAPACES DE METABOLIZAR FOSFITO COMO FUENTE DE FÓSFORO.

Plantas y hongos transgénicos capaces de metabolizar fosfito como fuente de fósforo.



Sistema, incluyendo métodos y composiciones, para preparar y utilizar plantas transgénicas y/u hongos transgénicos que metabolizan fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2009/007741.

Solicitante: Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV).

Nacionalidad solicitante: México.

Dirección: Av. Instituto Politécnico Nacional No. 2508 - Col. San Pedro Zacatenco 07360 Mexico MEJICO.

Inventor/es: HERRERA-ESTRELLA,Luis Rafael, LÓPEZ-ARREDONDO,Damar Lizbeth, HERRERA-ESTRELLA,Alfredo Heriberto.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/80 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para hongos.
  • C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.

PDF original: ES-2391351_A1.pdf

 

PLANTAS Y HONGOS TRANSGÉNICOS CAPACES DE METABOLIZAR FOSFITO COMO FUENTE DE FÓSFORO.

Fragmento de la descripción:

PLANTAS Y HONGOS TRANSGÉNICOS CAPACES DE METABOLIZAR FOSFITO COMO FUENTE DE FÓSFORO

5 Estado de la Técnica El fósforo es un elemento esencial para el crecimiento vegetal y fúngico. Este elemento, en forma oxidada, es incorporado en muchas de las biomoléculas en una célula vegetal o fúngica, proporcionapara proporcionar material genético, membranas, y mensajeros 1 o moleculares, entre otros. El fosfato inorgánico (Pi) es la fuente primaria de fósforo para las plantas. Por consiguiente, los fertilizantes a base de fosfato ofrecen un enfoque económico y ampliamente utilizado para mejorar el crecimiento vegetal. Sin embargo, los fertilizantes a base de fosfato proceden de recursos no renovables que se ha previsto que se agotarán en los próximos 15 setenta a cien años, o incluso antes si su tasa de utilización aumenta más rápido de lo esperado. Los fertilizantes a base de fosfato, comúnmente utilizados en la agricultura moderna generalmente no pueden ser utilizados eficientemente por las plantas cultivadas, debido a varios factores importantes. En primer lugar, el fosfato es altamente reactivo y puede formar 2 o complejos insolubles con muchos componentes del suelo, lo cual reduce la cantidad de fósforo disponible. En segundo lugar, los microorganismos del suelo pueden convertir rápidamente el fosfato en moléculas orgánicas que generalmente no pueden ser metabolizadas eficientemente por las plantas, lo cual reduce adicionalmente la cantidad de fósforo disponible. En tercer lugar, el crecimiento de malas hierbas puede ser estimulado por los 2 5 fertilizantes a base de fosfato, lo cual no solo reduce la cantidad de fósforo disponible aún más, sino que también puede fomentar que las malas hierbas compitan con las plantas cultivadas por el espacio y por los nutrientes. Las pérdidas debidas a la conversión del fosfato en formas inorgánicas y orgánicas que no están rápidamente disponibles para la captura y utilización por parte de la planta, y la competencia por parte de las malas hierbas, implica el 3 O uso de excesivas cantidades de fertilizante a base de fosfato, lo cual no sólo incrementa los costos de producción sino que también ocasiona severos problemas ecológicos. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de reducir la cantidad de fertilizante a base de fosfato utilizados en la agricultura. Una forma reducida de fosfato, el fosfito (Phi) , también se utiliza en el cultivo de 35 plantas. Se ha demostrado que el tratamiento con fosfito puede incrementar la producción vegetal (medida como tamaño del druto y biomasa) en aguacate y frutas cítricas. El fosfito puede ser transportado dentro de las plantas utilizando el mismo sistema de transporte que el fosfato y puede acumularse en tejidos vegetales durante largos períodos de tiempo. Sin embargo, aparentemente no hay evidencias de la existencia de ninguna enzima en plantas que pueda metabolizar el fosfito en fosfato, la fuente primaria de fósforo en plantas. Más aún, 5 incluso durante la ausencia de fosfato, el fosfito no puede aparentemente satisfacer los requerimientos nutricionales de fósforo de la planta. En consecuencia, a pesar de las similitudes con el fosfato, el fosfito es una forma de fósforo que generalmente no puede ser metabolizada directamente por las plantas, y por lo tanto no es un nutriente vegetal. No obstante, los "fertilizantes" de fosfito se venden comercialmente, a pesar de que no parece 1 O haber ninguna prueba, ni siquiera una indicación en la literatura científica de que las plantas puedan asimilar el fosfito. El fosfito puede promover el crecimiento vegetal indirectamente. Por ejemplo, el fosfito es utilizado como un agente anti-fúngico (un fungicida) sobre plantas cultivadas. Se piensa que el fosfito evita enfermedades causadas por oomycetes (mohos de agua) en plantas 15 tan diversas como patata, tabaco, aguacate, y papaya, entre otras. El fosfito por lo tanto, puede promover el crecimiento vegetal, no directamente como un nutriente vegetal, sino protegiendo a las plantas de los patógenos fúngicos que podrían de otro modo afectar el crecimiento vegetal. No obstante, los fungicidas a base de fosfito son a menudo etiquetados como fertilizantes. Este etiquetado erróneo puede estar fomentado por regulaciones 2 O gubernamentales que hacen el proceso de aprobación más corto y menos complejo si los fabricantes caracterizan los fungicidas como fertilizantes. Los mecanismos propuestos para que el fosfito actúe como un fungicida son múltiples. Por ejemplo, el fosfito puede actuar sobre los hongos inhibiendo las reacciones de fosforilación a través de un incremento en la acumulación de pirofosfato inorgánico (PPi) , el 2 5 cual a su vez puede interrumpir las rutas de fosfato que son metabólicamente críticas. Alternativamente, o adicionalmente, el fosfito puede inducir una respuesta natural de defensa en plantas. En cualquier caso, la eficacia del fosfito como fungicida puede estar influenciada por varios factores, que incluyen el medioambiente, tipo de patógeno, tipo de planta y la concentración. 3 O La concentración de fosfito en contacto con las plantas puede ser un factor crítico para la eficacia del fosfito ya que demasiado fosfito puede ser tóxico para las plantas. En particular, el fosfito puede competir con el fosfato por la entrada en las células vegetales, dado que el fosfito puede ser transportado dentro de las plantas mediante el sistema de transporte del fosfato. La toxicidad del fosfito puede deberse por lo tanto, a (1) asimilación 35 reducida del fosfato por las plantas, en combinación con (2) una incapacidad de utilizar el

fosfito como fuente de fósforo mediante oxidación a fosfato, lo cual ocasiona la acumulación de fosfito en las plantas. Además, el fosfito puede detectarse en las plantas como fosfato, lo cual evita que las plantas induzcan una ruta de recuperación de fósforo que promueve la supervivencia de la planta bajo condiciones de fosfato bajo. La toxicidad del fosfito afecta plantas tan diversas como Brassica nigra, Allium cepa (cebolla) , Zea mays L. (maíz) , y 5 Arabidopsis thaliana. Por consiguiente, la exposición de las plantas al fosfito necesita ser controlada muy cuidadosamente. Por lo tanto, se necesita un sistema mejor para explotar los beneficios del fosfito en las plantas al tiempo que se reduzcan sus inconvenientes. La generación de plantas transgénicas ha sido un instrumento en la creación de sistemas mejorados para la agricultura. Al menos cuatro sistemas de selección se han 1 O establecido para identificar plantas transgénicas mediante crecimiento selectivo. Cada sistema de selección está basado en la resistencia a un antibiótico (kanamicina o higromicina) o un herbicida (glifosato o fosfinotricina) . Sin embargo, cada sistema de selección tiene desventajas. Por ejemplo, cada sistema de selección puede tener problemas con la toxicidad. Además, la selección con antibióticos puede ser ineficaz dado que las plantas pueden tener 15 mecanismos de resistencia alternativos. Por otra parte, a excepción del sistema de selección que utiliza fosfinotricina, ninguno de los sistemas de selección proporciona un marcador de seleccion"universal" de selección para la mayoría o todas las plantas. Por lo tanto, se necesita un nuevo marcador de seleccionde selección para uso en la generación de plantas transgénicas. 20 Breve descripción de la invención La presente descripción proporcionaproporciona un sistema, incluyendo métodos y composiciones, para preparar y utilizar plantas transgénicas y/u hongos transgénicos que metabolizan fosfito como fuente de fósforo para favorecer al crecimiento. 25 Descripción de los dibujos La Figura 1 muestra un diagrama de flujo esquemático de un ejemplo del método para (i) preparar una planta transgénica (u hongo) que es capaz de metabolizar una forma reducida de fósforo, tal como fosfito, como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, 30 y/o (ii) utilizar, como un marcador de seleccion, un ácido nucleico que confiere capacidad para metabolizar una forma reducida de fósforo, tal como fosfito, como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, de acuerdo con aspectos descritos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

l. Un ácido nucleico que comprende: un gen quimérico que incluye (a) una región codificante que codifica para una enzima 5 fosfito deshidrogenasa y (b) un promotor de transcripción unido operativamente a la región codificante, donde el promotor es heterólogo con respecto a la región codificante y es funcional en plantas, hongos, o ambos, y en donde el gen quimérico proporciona suficiente expresión de la enzima, en una

1 O célula vegetal o fúngica que contiene el gen quimérico, para conferir una capacidad a la célula para metabolizar fosfito (Phi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, permitiendo así el crecimiento de la célula sin una fuente externa de fosfato (Pi) .

2. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde la enzima fosfito 15 deshidrogenasa es de origen bacteriano.

3. El ácido nucleico según la reivindicación 2, donde la enzima fosfito deshidrogenasa es PtxD de Pseudomonas stutzeri (SEQ ID NO:l) , un análogo o derivado de la PtxD de SEQ ID NO:l, o un homólogo similar a PtxD de otra especie bacteriana.

4. El ácido nucleico según la reivindicación 2, donde la enzima fosfito deshidrogenasa bacteriana tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs:l-14.

5. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde la enzima fosfito deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos que incluye una primera región que tiene un motivo de unión a NAD con similitud o identidad de secuencia con VGILGMGAIG (SEQ ID N0:15) , una segunda región que tiene similitud o identidad de secuencia con XPGALL VNPCRGSVVD (SEQ ID N0:16) , donde X es K o R, y una tercera región que

3 O tiene similitud o identidad de secuencia con GWX1PX2X3~X5GL (SEQ ID N0.19) , donde X1 es R, Q, T, o K, X2 es A, V, Q, R, K, H, o E, X3 es Lo F, ~es G, F, o S, y X5 es T, R, M, L, A, oS.

6. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde la enzima fosfito

3 5 deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a PtxD de Pseudomonas stutzeri (SEQ ID NO:l) .

7. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde el gen quimérico incluye además un terminador de la transcripción que está unido operativamente a la región codificante y es heterólogo con respecto a dicha región codificante.

8. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde el promotor es un promotor vegetal o un promotor viral de un virus vegetal y es capaz de inducir la suficiente expresión de la enzima en una célula vegetal.

9. El ácido nucleico según la reivindicación 8, donde el promotor es el 1 O promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor.

1O. El ácido nucleico según la reivindicación 8, donde el promotor es inducible mediante baja disponibilidad de fosfato.

11. El ácido nucleico según la reivindicación 8, donde el promotor es un promotor del gen PLDZ2 de Arabidopsis thaliana.

12. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde el gen quimérico es capaz

de inducir la suficiente expresión de la enzima tanto en una célula vegetal como en una célula 2 O fúngica que contengan el gen quimérico.

13. El ácido nucleico según la reivindicación 1, donde el promotor es un promotor fúngico capaz de inducir la suficiente expresión de la enzima en una célula fúngica.

14. Una célula vegetal que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y que es capaz de metabolizar fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.

15. La célula vegetal según la reivindicación 14, que adicionalmente comprende

3 O un ácido nucleico que expresa una enzima hipofosfito deshidrogenasa bacteriana en la célula vegetal.

16. La célula vegetal según la reivindicación 15, donde los ácidos nucleicos

colectivamente confieren una capacidad a la célula para metabolizar hipofosfito (Hphi) como 3 5 fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.

17. La célula vegetal según la reivindicación 16, donde la expresión de la enzima fosfito deshidrogenasa, la enzima hipofosfito deshidrogenasa bacteriana, o ambas están controladas mediante un promotor específico de raíz.

18. La célula vegetal según la reivindicación 14, donde la célula vegetal es una célula de alga eucariótica.

19. La célula vegetal según la reivindicación 18, donde la célula de alga es una célula Chlamydomonas.

20. La célula vegetal según la reivindicación 14, donde la célula vegetal es de una especie de planta vascular.

21. Una planta compuesta de una pluralidad de células vegetales según la reivindicación 14.

22. Una planta compuesta de una pluralidad de células vegetales según la reivindicación 20.

23. La planta de la reivindicación 22, donde la planta es de una especie de planta de cultivo.

24. La planta de la reivindicación 23, donde la especie de la planta de cultivo se selecciona a partir del grupo que consiste en: maíz, soja, arroz, patata, tomate, caña de azúcar, y trigo.

25. Una célula fúngica que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 12, y 13 y que es capaz de metabolizar fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.

26. La célula fúngica según la reivindicación 25, que adicionalmente comprende un ácido nucleico que expresa una enzima hipofosfito deshidrogenasa bacteriana en la célula fúngica.

27. La célula fúngica según la reivindicación 26, donde los ácidos nucleicos colectivamente confieren una capacidad a la célula para metabolizar hipofosfito (Hphi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.

28. La célula fúngica según la reivindicación 25, en donde la célula fúngica es de una especie de Trichoderma.

29. Un método para reducir infecciones fúngicas en plantas, que comprende: aplicar una pluralidad de las células fúngicas de la reivindicación 25 a una forma de

1 O semilla de plantas, a las plantas en sí mismas, al suelo en el cual las plantas están o estarán dispuestas, o a una combinación de las mismas.

30. La célula fúngica según la reivindicación 25, donde dicha célula fúngica es

un miembro de una especie de hongo micorrizal capaz de formar una relación simbiótica con 15 una planta.

31. Una planta asociada con una pluralidad de células fúngicas según la reivindicación 30 para formar micorrizas.

32. La planta según la reivindicación 31, donde las células fúngicas hacen a la planta capaz de crecer sobre un medio que contiene fosfito (Phi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento.

33. Un método para fertilizar una planta de cultivo utilizando hipofosfito y/o 2 5 fosfito como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, incluyendo la planta de cultivo

(a) una pluralidad de células que comprenden el ácido nucleico de la reivindicación 1, (b) formando micorrizas con un hongo micorrizal que comprende el nucleico de la reivindicación 1, y/o (e) estando asociada con un hongo Trichoderma que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1, donde el método comprende:

3 O aplicar al menos una forma reducida de fósforo a la planta y/o al suelo adyacente a la planta, de modo que la forma reducida sea metabolizada a fosfato por la planta y/o que el hongo favorezca el crecimiento y productividad de la planta.

34. Un método para fertilizar la planta según la reivindicación 22, que 35 comprende:

aplicar al menos una forma reducida de fósforo a la planta y/o al suelo adyacente a la planta, de modo que la forma reducida sea metabolizada a fosfato por la planta para favorecer el crecimiento y productividad de la planta.

35. Un método para tratar residuos líquidos para disminuir su contenido en

fósforo reducido, que comprende: poner en contacto (i) agua que contiene hipofosfito y/o fosfito como contaminante y

(ii) una pluralidad de las células vegetales y/o células fúngicas que comprenden el nucleico

de la reivindicación 1, de modo que al menos una porción del hipofosfito y/ o fosfito sea 1 O oxidado a fosfito y/o fosfato.

36. El método según la reivindicación 35, donde la etapa de poner en contacto incluye una paso de poner en contacto el agua y una pluralidad de plantas vasculares compuestas de células vegetales que comprenden el ácido nucleico de la reivindicación l.

37. Un método para aislar células transformadas que contienen el ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende: poner en contacto células seleccionadas a partir de células vegetales y células fúngicas con una composición que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1; y

2 O hacer proliferar selectivamente una o más de las células que han sido transformadas mediante el ácido nucleico cultivando las células en un medio que contiene fosfito y que carece de suficiente fosfato para favorecer el crecimiento.

38. Un método para utilizar el ácido nucleico de la reivindicación 1 para la 2 5 producción de una planta transgénica, que comprende:

seleccionar por crecimiento células vegetales que comprenden el ácido nucleico de la reivindicación 1 como un marcador de selección durante la producción de una planta transgénica.

39. Un método para obtener una planta transformada con un ácido nucleico que codifica para una enzima fosfito deshidrogenasa que se expresa a partir del ácido nucleico como un marcador de selección, que comprende:

poner en contacto células vegetales y una composición que incluye el ácido nucleico bajo condiciones que promueven la introducción del ácido nucleico en al menos un 3 5 subconjunto de las células vegetales;

cultivar las células vegetales en un medio que contiene fosfito como una fuente primaria o exclusiva de fósforo para crecimiento; seleccionar células vegetales transformadas producidas mediante las etapas de poner en contacto y cultivar, y expresar la enzima fosfito deshidrogenasa como evidenciada por 5 crecimiento en el medio; y regenerar al menos una porción de las células vegetales transformadas, en una planta transgénica.

40. El método según la reivindicación 39, donde la composición incluye células 1 O de Agrobacterium que suministran el ácido nucleico durante la etapa de poner en contacto.

41. El método según la reivindicación 39, donde la composición incluye proyectiles que son disparados a las células vegetales en la etapa de poner en contacto.

42. Una planta, que comprende: un ácido nucleico que incluye un gen quimérico que expresa una enzima fosfito deshidrogenasa de modo que la planta es capaz de metabolizar fosfito (Phi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, permitiendo así el crecimiento de la planta sin una fuente externa de fosfato (Pi) .

43. La planta según la reivindicación 42, donde el ácido nucleico está establemente integrado dentro del genoma de la planta.

44. La planta de la reivindicación 42, según donde la planta es una planta 2 5 vascular.

45. La planta de la reivindicación 42, según donde la planta es una especie de alga.

30 46. Un hongo, que comprende: un ácido nucleico que incluye un gen quimérico que expresa una enzima fosfito deshidrogenasa de modo que el hongo es capaz de metabolizar fosfito (Phi) como fuente de fósforo para favorecer el crecimiento, permitiendo así el crecimiento del hongo sin una fuente externa de fosfato (Pi) .

47. El hongo según la reivindicación 46, donde el ácido nucleico está establemente integrado dentro del genoma del hongo.

48. El hongo según la reivindicación 46, donde el hongo es una especie de 5 Trichoderma.

49. El hongo según la reivindicación 46, donde el hongo es de la especie micorrizal capaz de formar una relación simbiótica con una planta.

10 50. El hongo según la reivindicación 46, que adicionalmente comprende una planta asociada con el hongo para formar micorrizas.


 

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