Plantas transgénicas con una distribución controlada de un rasgo a una progenie.

Planta, semilla o célula de planta que expresa un rasgo de interés,

comprendiendo dicha planta, dicha semilla odicha célula de planta:

(i) en un primer locus de un cromosoma nuclear una primera secuencia de nucleótidos heteróloga quecomprende un primer fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica dicho rasgo de interés, y(ii) en un segundo locus de un cromosoma nuclear homólogo con dicho cromosoma nuclear (i) una segundasecuencia de nucleótidos heteróloga que comprende un segundo fragmento de la secuencia de nucleótidosque codifica dicho rasgo de interés;

exhibiendo dicha planta, dicha semilla o dichas células de planta dicho rasgo funcional de interés debido a un transempalme mediado por inteínas entre una proteína o un polipéptido que se ha codificado por dicha primera secuenciade nucleótidos heteróloga y una proteína o un polipéptido que se ha codificado por dicha segunda secuencia denucleótidos heteróloga.

Plantas transgénicas con una distribución controlada de un rasgo a una progenie

Campo del invento

El presente invento se refiere a semillas híbridas. El invento se refiere también a un organismo de planta multicelular transgénica que expresa un rasgo de interés y que tiene una distribución controlada de dicho rasgo a una progenie o a otros organismos. El invento se refiere también a un organismo de planta multicelular transgénica que expresa dos rasgos de interés, teniendo dichos rasgos una distribución controlada a una progenie. Preferiblemente, uno de dichos rasgos es la esterilidad masculina.

Antecedentes del invento

El uso comercial de especies de plantas cultivadas tratadas por ingeniería genética ha causado preocupaciones acerca de la posible transferencia de transgenes y de rasgos codificados por transgenes a partir de plantas modificadas genéticamente (plantas GM acrónimo de genetically modified) a variedades puras de origen, variedades relativas silvestres u otras variedades de plantas no GM o especies de plantas cultivadas relacionadas (Ellstrand, N. C., 2001, Plant Physiol. 125, 1543-1545; Quist & Chapela, 2001, Nature, 414, 541-543) , que podrían cambiar el equilibrio ecológico en los ecosistemas afectados o conducir a otros problemas, ante todo de tipo socioeconómico. Adicionalmente, hay un cierto miedo de que los transgenes, especialmente los genes de resistencia a antibióticos usados como marcadores de transformación, puedan escapar, por medio de una denominada transferencia horizontal, hacia los microorganismos circundantes (Chiter y colaboradores, 2000, FEBS Lett., 481, 164-168) , modificando de esta manera a la microflora de una manera indeseable.

Aunque muchas de estas preocupaciones no están bien justificadas científicamente (Christou, P., 2002, Transgenic Res., 11, iii-v) , la creación de sistemas de administración de transgenes seguros y controlados es altamente deseable, puesto que podría evitar potenciales problemas en el futuro y ayudará a proteger al plasma germinal de especies de plantas existentes de una manera sumamente eficaz. Además, existen problemas causados por una contaminación con cultivares transgénicos de plantas cultivadas que han crecido orgánicamente o de plantas cultivadas que no son GM. Esto tiene un grave impacto sobre la comercialización de plantas cultivadas transgénicas así como no transgénicas, un tema que no puede ser ignorado por los productores.

A diferencia de otros productos generados por los seres humanos, los productos creados por biotecnología son potencialmente unas máquinas auto-replicantes. Por lo tanto, cualquier material transgénico creado por una tecnología actual y liberado al medio ambiente tiene un potencial de persistir allí durante un período de tiempo muy largo. Una práctica corriente del tratamiento por ingeniería genética de plantas está basado en el uso de casetes de expresión y de vectores que contienen una secuencia de codificación continua para el gen de interés. Dichas casetes de expresión son integradas dentro de un cromosoma anfitrión y después de una hibridación o de otro intercambio de información genética entre una planta GM y otro organismo, ya sea lícito o ilícito, la casete de expresión es transmitida con una alta probabilidad a una progenie o a otro recipiente como una unidad de transcripción funcional.

El documento de solicitud de patente internacional WO00/52146 describe ideas generales para encriptar un rasgo de interés por disociación de gen (es) en dos o más fragmentos y reunir los fragmentos por trans-empalme después de emparejar organismos parentales, en donde los organismos parentales proporcionan dichos fragmentos. El documento WO00/52146 no va más allá de unas ideas generales. Él no contiene una descripción habilitadora sobre cómo estas ideas pueden ser reducidas a la práctica. Notablemente, no contiene ningún ejemplo. El documento WO00/71701 describe el ensamble de una proteína funcional mediante interacción de trans-empalme de una proteína mediado por inteínas para mejorar la contención de un transgén que codifica dicha proteína. El documento WO00/71701 no describe poner juntos a fragmentos de una proteína por apareamiento de organismos parentales. Además, la frecuencia de transmisión de un transgén de acuerdo con el documento WO00/71701 no es lo suficientemente baja para aplicaciones a gran escala tales como la agricultura, particularmente cuando un transgén proporciona una ventaja selectiva.

El documento WO0116287 se refiere a la creación de una posición alélica para transgenes, cuya expresión determina un fenotipo, con la meta de que los transgenes se segreguen a diferentes gametos. Esta solicitud de patente no afronta el problema de controlar el movimiento de los transgenes, sino más bien la generación de rasgos, específicamente la esterilidad masculina, codificados por al menos dos transgenes. Además, no menciona el transempalme mediado por inteínas. Esta solicitud no describe el control sobre el movimiento de rasgos por disociación de un gen que codifica un rasgo en dos o más fragmentos.

El ensamble de rasgos a partir de unas partes que codifican el rasgo no tiene un alto valor sin conocer cómo se han de conseguir las posiciones más favorables de los fragmentos codificadores prácticamente de la manera más factible, con el fin de proporcionar el control más estricto acerca de la transmisión deseada de dicho rasgo. Para aplicaciones a gran escala tales como para la agricultura, la seguridad biológica requiere que la transmisión indeseada de un transgén sea reducida a una frecuencia de prácticamente cero.

Las plantas cultivadas que expresan como un rasgo de interés la esterilidad masculina o femenina se usan ampliamente para la producción de semillas híbridas. Las plantas cultivadas híbridas tienen en promedio una ventaja de rendimiento medio de 20 % con respecto a las variedades innatas, y la producción de semillas híbridas es una gran industria. Muchas diferentes tecnologías se usan para producir semillas híbridas (como recopilación véase la cita de: Pérez-Prat E. & van Lookeren Campagne, MM, 2002, Trends Plant Sci., 7, 199-202) . Estas tecnologías pueden ser divididas condicionalmente en por lo menos cuatro grupos de acuerdo con el mecanismo de control de la polinización: mecánico, químico, genético y transgénico. Sin embargo, un requisito crítico es común para todas estas tecnologías: idealmente un linaje estéril masculino en 100 % debería ser usado para el proceso de hibridación y se debería conseguir en una progenie F1una restauración de la fertilidad masculina en un 100%. Dichos estrictos requisitos son absolutamente necesarios para producir semillas híbridas libres de contaminación con semillas autofecundadas.

Los actuales métodos de producción de semillas híbridas son insatisfactorios en los anteriores aspectos. Estos procesos o bien son caros, como en el caso del despenachado mecánico (castración) del maíz, o bien son “susceptibles de fugas” tal como en el caso de los enfoques genéticos, o ambas cosas a la vez, como en el caso de un método basado en un tratamiento químico (p.ej. documento de patente de los EE.UU. US4569688) .

Los enfoques genéticos incluyen preferiblemente el uso de linajes con mutantes de esterilidad masculina citoplasmática (CMS = acrónimo de cytoplasmic male sterility) y restauradores de la fertilidad (p.ej. el documento WO02098209) . Los enfoques transgénicos usan predominantemente plantas con esterilidad masculina nuclear (NMS, acrónimo de nuclear male sterility) o CMS, tratadas por ingeniería genética y la restauración de la fertilidad en una progenie F1 (documentos WO8910396; US5530191; US6255564; WO9832325; WO9201799: US6392119; WO0116287) . Estos enfoques requieren también el uso de un denominado linaje mantenedor con el fin de propagar y mantener el linaje estéril masculino.

Los sistemas transgénicos construidos a base de un transgén que proporciona esterilidad masculina y de otro transgén que es portador de la función de restaurar la fertilidad masculina (p.ej. el documento US62555640) no garantizan ni la restauración completa de la fertilidad masculina en una progenie híbrida ni la completa eliminación de efectos potencialmente negativos del transgén que proporciona esterilidad masculina sobre la salud general de dicha progenie. En otras palabras, estos sistemas son susceptibles de fugas. Además, ninguno de los mencionados sistemas anteriormente mencionados ofrece una vía conveniente de producir y mantener el linaje estéril... [Seguir leyendo]

1. Planta, semilla o célula de planta que expresa un rasgo de interés, comprendiendo dicha planta, dicha semilla o dicha célula de planta:

(i) en un primer locus de un cromosoma nuclear una primera secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende un primer fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica dicho rasgo de interés, y

(ii) en un segundo locus de un cromosoma nuclear homólogo con dicho cromosoma nuclear (i) una segunda secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende un segundo fragmento de la secuencia de nucleótidos que codifica dicho rasgo de interés;

exhibiendo dicha planta, dicha semilla o dichas células de planta dicho rasgo funcional de interés debido a un transempalme mediado por inteínas entre una proteína o un polipéptido que se ha codificado por dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga y una proteína o un polipéptido que se ha codificado por dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga.

2. Planta, semilla o célula de planta de acuerdo con la reivindicación 1, exhibiendo dicha planta, dicha semilla o dicha célula de planta dos rasgos de interés, un rasgo (1) y un rasgo (2) que comprende:

(i) en un primer locus de un cromosoma nuclear una primera secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende:

un primer fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el rasgo (1) y un primer fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el rasgo (2) , y

(ii) en un segundo locus de un cromosoma nuclear homólogo con dicho cromosoma nuclear de (i) , una segunda secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende:

un segundo fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el rasgo (1) , un segundo fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el rasgo (2) ;

exhibiendo dicha planta, semilla o célula dicho rasgo (1) debido a un trans-empalme mediado por inteínas entre una proteína o un polipéptido que se ha codificado por dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga y una proteína

o un polipéptido que se ha codificado por dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga; y

exhibiendo dicho rasgo (2) debido a un trans-empalme mediado por inteínas entre una proteína o un polipéptido que se ha codificado por dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga y una proteína o un polipéptido que se ha codificado por dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga;

siendo dicho rasgo (1) una resistencia a herbicidas y siendo dicho rasgo (2) una esterilidad masculina.

3. Semillas obtenibles por cruce de un organismo de planta multicelular transgénica con otra planta, expresando dicha planta multicelular transgénica dos rasgos de interés, un rasgo (1) y un rasgo (2) y comprendiendo:

(i) en un primer locus de un cromosoma nuclear, una primera secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende:

un primer fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el rasgo (1) y un primer fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el rasgo (2) ; y

(ii) en un segundo locus de un cromosoma nuclear homólogo con dicho cromosoma nuclear de (i) , una segunda secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende:

un segundo fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el rasgo (1) y un segundo fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el rasgo (2) ;

exhibiendo dicha planta multicelular transgénica dicho rasgo funcional (1) debido a un trans-empalme mediado por inteínas entre una proteína o un polipéptido que se ha codificado por dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga y una proteína o un polipéptido que se ha codificado por dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga; y

exhibiendo ellas dicho rasgo funcional (2) debido a un trans-empalme mediado por inteínas entre una proteína o un polipéptido que se ha codificado por dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga y una proteína o un polipéptido que se ha codificado por dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga.

4. Las semillas de acuerdo con la reivindicación 3, en las que el rasgo (1) es una resistencia a herbicidas y el rasgo

(2) es una esterilidad masculina.

5. Plantas que han crecido a partir de las semillas de la reivindicación 3, en las que la progenie de dichas plantas no es viable.

6. Las plantas de acuerdo con la reivindicación 5, en las que las semillas de progenie de dichas plantas no germinan.

7. Las plantas de la reivindicación 5 ó 6, que contienen un gen inactivo de control de la germinación de semillas que puede ser activado por expresión de una proteína activadora.

8. Uso de las semillas o plantas de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 hasta 7, para expresar una proteína de interés, particularmente una proteína farmacéutica.

9. Planta o semilla o célula que comprende en un locus de un cromosoma nuclear una secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende: un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica un rasgo (1) , y un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica un rasgo (2) ;

expresando dicha planta, semilla o célula: una proteína de fusión que comprende un fragmento de una inteína y un polipéptido codificado por dicho fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica un rasgo (1) , y

una proteína de fusión que comprende un fragmento de una inteína y un polipéptido codificado por dicho fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica un rasgo (2) .

10. Un procedimiento de producir

(i) una primera planta que tiene, en un primer locus de un cromosoma nuclear, una primera secuencia de nucleótido heteróloga que comprende un primer fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica un rasgo de interés, y

(ii) una segunda planta que tiene, en un segundo locus de un cromosoma nuclear homólogo con dicho cromosoma nuclear de la etapa (i) , una segunda secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende un segundo fragmento de la secuencia de nucleótidos que codifica dicho rasgo de interés,

en el que las etapas (i) y (ii) se llevan a cabo por las etapas de

(a) introducir una secuencia de nucleótidos heteróloga parental que comprende dicha primera y dicha segunda secuencias de nucleótidos heterólogas dentro de un cromosoma nuclear de organismos parentales o células de los mismos por transformación,

(b) opcionalmente seleccionar organismos o células de los mismos que tienen dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental integrada en un deseado cromosoma o locus de cromosoma,

(c) subsiguientemente disociar dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental de manera tal que dicha primera y dicha segunda secuencias de nucleótidos heterólogas estén situadas en cromosomas homólogos en diferentes organismos de plantas o células, obteniendo de esta manera dicha primera o dicha segunda plantas.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que una planta multicelular obtenible cruzando sexualmente dicha primera y dicha segunda plantas expresa dos rasgos de interés, un rasgo (1) y un rasgo (2) , teniendo ambos rasgos una distribución controlada a una progenie, en que

(i’) dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga de la etapa (i) comprende un primer fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el rasgo (1) y un primer fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el rasgo (2) ; y

(ii’) dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga de la etapa (ii) comprende: un segundo fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el rasgo (1) y un segundo fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el rasgo (2) .

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que es rasgo (1) es una resistencia a herbicidas y el rasgo (2) es una esterilidad masculina o femenina.

13. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la etapa (c) comprende una escisión de dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga a partir de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental, seguida opcionalmente por una reintegración de dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga escindida dentro de un locus de un cromosoma que es homólogo con respecto al cromosoma de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental.

14. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la etapa (c) comprende una escisión de dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga a partir de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental, seguida opcionalmente por una reintegración de dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga escindida dentro de un locus de un cromosoma que es homólogo con respecto al cromosoma de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental.

15. El procedimiento de una de las reivindicaciones 13 o 14, en el que dicha primera y/o dicha segunda secuencias de nucleótidos heterólogas en dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental está/n contenidas en un transposón no autónomo y dicha escisión comprende proporcionar una transposasa para dicho transposón.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que

(A) dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga en dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental está contenida en un primer transposón no autónomo y dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga está contenida en un segundo transposón no autónomo, y

(B) dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga es escindida por provisión de una primera transposasa funcional con dicho primer transposón no autónomo y dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga es escindida por provisión de una segunda transposasa funcional con dicho segundo transposón no autónomo.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicho primero y dicho segundo transposones en dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental se solapan de manera tal que la escisión de dicha primera o dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga conduce a una rotura de dicho segundo o dicho primero transposón no autónomo.

18. El procedimiento de una de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga en dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental está flanqueada por sitios de recombinación de una primera recombinasa específica para un sitio y

en el que dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga en dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental está flanqueada por sitios de recombinación de una segunda recombinasa específica para un sitio.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que un segmento 1 y un segmento 2 de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental se solapan, en el que:

el segmento 1 comprende dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga flanqueada por los sitios de recombinación funcionales con dicha primera recombinasa específica para un sitio y el segmento 2 comprende dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga flanqueada por los sitios de recombinación funcionales con dicha segunda recombinasa específica para un sitio.

20. El procedimiento de una de las reivindicaciones 10 hasta 14, en el que dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga en dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental está flanqueada por diferentes sitios de recombinación de una integrasa específica para un sitio y dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga en dicha secuencia de nucleótidos heteróloga parental está flanqueada por diferentes sitios de recombinación de la integrasa específica para un sitio, y se lleva a cabo la etapa (c)

- proporcionando dicha integrasa específica para un sitio a dicho organismo parental o a células del mismo,

- seleccionando células de progenie de dicho organismo parental que contiene dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga pero no contiene dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga, y

- seleccionando células de progenie de dicho organismo parental que contiene dicha segunda secuencia de nucleótidos heteróloga pero no contiene dicha primera secuencia de nucleótidos heteróloga.

21. El procedimiento de una de las reivindicaciones 15 hasta 20, en el que dicha transposasa, dicha recombinasa específica para un sitio, y dicha integrasa específica para un sitio son proporcionadas hibridando o cruzando con una planta o con células de la planta que contienen un gen que codifica dicha transposasa o dicha recombinasa o por transformación mediada por Agrobacterium, transfección vírica, bombardeo de partículas, electroporación o transformación mediada por PEG con un gen que codifica dicha transposasa o dicha recombinasa.

22. Procedimiento de una de las reivindicaciones 10 hasta 21, en el que dicho primero y dicho segundo loci son unos loci correspondientes en dichos cromosomas homólogos.

23. El procedimiento de una de las reivindicaciones 10 hasta 22, en el que dicha primera y dicha segunda plantas son hechas homocigóticas para dicha primera y dicha segunda secuencias de nucleótidos heterólogas.

24. El procedimiento de una de las reivindicaciones 10 hasta 23, en el que dicha primera y/o dicha segunda

secuencias de nucleótidos heterólogas contiene (n) un intrón para el cis-empalme de ARN de un producto de 5 transcripción de dicha primera o dicha segunda secuencias de nucleótidos heterólogas.

25. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho rasgo de interés está implicado en una esterilidad masculina o femenina.

26. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho rasgo se selecciona entre el siguiente grupo:

una resistencia a herbicidas, una resistencia a insecticidas, un marcador seleccionable, un marcador contra10 seleccionable, un factor de transcripción, enzimas modificadoras de ADN o ARN, la producción de una proteína de interés.