Un agente de formación de imágenes que comprende un conjugado de Fórmula I:

en la que:

Z1 está fijado al extremo N-terminal de cMBP, y es H o MIG;

Z2 está fijado al extremo C-terminal de cMBP y es OH, OBC o MIG, en la que Bc es un catión biocompatible;

cMBP es un péptido cíclico de unión a cMet de 17 a 30 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos (SEC-1):

Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6; en la que X1 es Asn, His o Tyr;

X2 es Gly, Ser, Thr o Asn;

X3 es Thr o Arg;

X4 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser;

X5 es Ser o Thr;

X6 es Asp o Glu;

y Cysa-d son cada uno restos de cisteína de manera que esos restos a y b así como c y d se ciclan para formar dos enlaces disulfuro distintos;

MIG es un grupo inhibidor del metabolismo que es un grupo biocompatible que inhibe o suprime el metabolismo in vivo del péptido;

L es un grupo de engarce sintético de fórmula -(A)m- en la que cada A es independientemente -CR2-, -CR≥CR-, -C≡C-, -CR2CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C≥O)NR-, -NR(C≥S)NR-, -SO2NR-, -NRSO2-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, un grupo cicloheteroalquileno C4-8, un grupo cicloalquileno C4-8, un grupo arileno C5-12, o un grupo heteroarileno C3-12, un aminoácido, un azúcar o un componente básico de polietilenglicol (PEG) monodisperso; cada R se elige independientemente de entre H, alquilo C1-4, alquenilo C2-4, alquinilo C2-4, alcoxialquilo C1-4 o hidroxialquilo C1-4,

m es un número entero de un valor de 1 a 20;

n es un número entero de un valor de 0 ó 1;

IM es un resto indicador de formación de imágenes ópticas adecuado para la formación de imágenes del cuerpo de los mamíferos in vivo usando luz de una longitud de onda del verde al infrarrojo cercano de 600-1.200 nm.

Péptidos de unión a HGF marcados para la formación de imágenes.

Campo de la invención La presente invención se refiere a péptidos de unión a cMET marcados adecuados para la formación de imágenes ópticas in vivo. Los péptidos se marcan con un grupo indicador óptico adecuado para la formación de imágenes en la región del rojo al infrarrojo cercano. También se desvelan procedimientos de formación de imágenes in vivo, especialmente de uso en el diagnóstico del cáncer colorrectal (CCR) .

Antecedentes de la invención

En el documento WO 2005/030266 se desvela que existe la necesidad médica del diagnóstico precoz del cáncer colorrectal (CCR) . En el documento WO 2005/030266 se desvelan agentes de contraste de formación de imágenes ópticas que tienen afinidad por una diana biológica anormalmente expresada en el CCR. La diana biológica está seleccionada de entre: COX-2, beta-catenina, E-cadherina, P-cadherina, diversas quinasas, Her-2, metaloproteinasas de matriz (MMP) , ciclinas, P53, timidilato sintasa, receptores VEGF, receptores EGF, K-ras, proteína APC, catepsina B, uPAR, cMET, mucinas y receptores de gastrina. Se dice que de tales dianas son preferentes (p. 7 líneas 11-12) : cMET, mmP-14, COX-2, beta-catenina y catepsina B. El vector del documento WO 2005/030266 puede ser: un péptido, un resto peptoide, un oligonucleótido, un oligosacárido, un compuesto relacionado con los lípidos o una molécula pequeña farmacológica orgánica tradicional. El resto indicador es preferentemente un colorante que interactúa con la luz en la región de longitud de onda del ultravioleta a la parte infrarroja del espectro electromagnético.

El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , también conocido como factor de dispersión (SF) , es un factor de crecimiento que está implicado en diversos procesos fisiológicos, tales como la cicatrización de heridas y la angiogénesis. La interacción de HGF con su receptor de alta afinidad (cMET) está implicada en el crecimiento, la invasión y la metástasis tumoral.

Knudsen y col. han revisado el papel de HGF y cMet en el cáncer de próstata, con posibles implicaciones para la formación de imágenes y para la terapia [Adv. Cancer Res., 91, 31-67 (2004) ]. En el documento WO 03/057155 se divulgan anticuerpos anti-met marcados para el diagnóstico y el tratamiento.

En el documento WO 2004/078778 se desvelan polipéptidos o construcciones de péptidos multiméricos que se unen cMet o a un complejo que comprende cMet y HGF. Se divulgan aproximadamente 10 clases estructurales diferentes de péptidos. En el documento WO2004/078778 se desvela que los péptidos pueden marcarse con una marcador detectable para aplicaciones in vitro e in vivo, o con un fármaco para aplicaciones terapéuticas. El marcador detectable puede ser: una enzima, un compuesto fluorescente, un colorante óptico, un ion metálico paramagnético, un agente de contraste por ultrasonidos o un radionúclido. Se indica que los marcadores preferentes del documento WO 2004/078778 son radiactivos o paramagnéticos, y más preferentemente comprenden un metal que está quelado por un metal quelante.

La presente invención.

La presente invención proporciona agentes de formación de imágenes adecuados para la formación de imágenes ópticas in vivo, que comprenden péptidos cíclicos de unión a cMET, y un resto indicador de formación de imágenes ópticas adecuado para formar imágenes del cuerpo de los mamíferos in vivo usando luz de una longitud de onda del verde al infrarrojo cercano de 600-1.200 nm. Los péptidos cíclicos de unión a cMET están relacionados con una de las clases estructurales de péptido del documento WO 2004/078778, y tienen afinidad de unión óptima por cMet. Estos péptidos se obtuvieron a partir de la expresión en fagos y se seleccionaron por su afinidad por cMet y por no competir con HGF, tal como se divulga en el documento WO2004/078778. Los péptidos de unión a cMET de la presente invención tienen preferentemente por lo menos uno de sus extremos terminales protegido por grupos inhibidores del metabolismo (MIG) . Esto es una consideración importante para las aplicaciones in vivo, en las que las peptidasas y las enzimas endógenas metabolizarían por lo demás el péptido rápidamente, con la consiguiente pérdida de afinidad de unión a cMET, y por tanto la pérdida de dirección selectiva in vivo.

La presente invención muestra que la mejor manera de usar los péptidos de unión a cMET in vivo implica el uso de un indicador óptico, a diferencia de otras modalidades de formación de imágenes (por ejemplo, nuclear, MRI o por ultrasonido) , y también proporciona indicadores de formación de imágenes ópticas preferentes. Resulta preferente la región del verde al infrarrojo cercano (luz de longitud de onda de 500-1.200 nm) , ya que la región tiene una superposición espectral mínima con los materiales y tejidos endógenos, tales como la hemoglobina, las porfirinas, la melanina, y el colágeno [Licha, Topics Curr. Chem., 222, 1-29 (2002) ]. Otros contribuidores importantes para la autofluorescencia son NADH, FAD y elastina.

Descripción detallada de la invención.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un agente de formación de imágenes que comprende un conjugado de Fórmula I:

en la que:

Z1 está fijado al extremo N-terminal de cMBP, y es H o MIG; Z2 está fijado al extremo C-terminal de cMBP y es OH, OBC, o MIG, en la que Bc es un catión biocompatible; cMBP es un péptido cíclico de unión a cMET de 17 a 30 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos (SEC-1) :

Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6; en la que X1 es Asn, His o Tyr; X2 es Gly, Ser, Thr o Asn; X3 es Thr o Arg; X4 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser; X5 es Ser o Thr; X6 es Asp o Glu; y Cysa-d son cada uno restos de cisteína de manera que los restos a y b así como c y d se ciclan para formar dos enlaces disulfuro distintos; MIG es un grupo inhibidor del metabolismo que es un grupo biocompatible que inhibe o suprime el metabolismo in vivo del péptido cMBP;

L es un grupo de engarce sintético de fórmula - (A) m- en la que cada A es independientemente -CR2-, -CR=CR-, -C≡C-, -CR2CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR (C=O) NR-, -NR (C=S) NR-, -SO2NR-, -NRSO2-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, - CR2NRCR2-, un grupo cicloheteroalquileno C4-8, un grupo cicloalquileno C4-8, un grupo arileno C5-12, o un grupo heteroarileno C3-12, un aminoácido, un azúcar o un componente básico de polietilenglicol (PEG) monodisperso; cada R se elige independientemente de entre H, alquilo C1-4, alquenilo C2-4, alquinilo C2-4, alcoxialquilo C1-4

o hidroxialquilo C1-4, m es un número entero de un valor de 1 a 20; n es un número entero de un valor de 0 ó 1; IM es un resto indicador de formación de imágenes ópticas adecuado para la formación de imágenes del cuerpo de los mamíferos in vivo usando luz de una longitud de onda del verde al infrarrojo cercano de 600

1.200 nm.

Por la expresión "agente de formación de imágenes" se entiende un compuesto adecuado para la formación de imágenes del cuerpo de los mamíferos in vivo. Preferentemente, el mamífero es un sujeto humano. La formación de imágenes puede ser invasiva (por ejemplo, intraoperatoria o endoscópica) o no invasiva. El procedimiento de formación de imágenes preferente es la endoscopia. Aunque el conjugado de Fórmula I es adecuado para la formación de imágenes in vivo, también puede tener aplicaciones in vitro (por ejemplo, ensayos que cuantifican cMet en muestras biológicas o la visualización de cMet en muestras de tejido) . Preferentemente, el agente de formación de imágenes se usa para la formación de imágenes in vivo.

El grupo Z1 sustituye al grupo amino del último resto de aminoácido. De esta manera, cuando Z1 es H, el extremo amino terminal del cMBP termina en un grupo NH2 libre del último resto de aminoácido. El grupo Z2 sustituye al grupo carbonilo del último resto de aminoácido. De esta manera, cuando Z2 es OH, el extremo carboxilo terminal de cMBP termina en el grupo CO2H libre del último resto de aminoácido, y cuando Z2 es OBC ese grupo carboxilo terminal se ioniza como un grupo CO2Bc.

Por la expresión "grupo inhibidor del metabolismo" (MIG) se entiende un grupo biocompatible que inhibe o suprime el metabolismo in vivo del péptido cMBP en el extremo amino terminal (Z1) o en el extremo carboxilo terminal (Z2) . Tales grupos son bien conocidos para los expertos en la materia y se eligen convenientemente,... [Seguir leyendo]

1 Un agente de formación de imágenes que comprende un conjugado de Fórmula I:

en la que:

Z1 está fijado al extremo N-terminal de cMBP, y es H o MIG; Z2 está fijado al extremo C-terminal de cMBP y es OH, OBC o MIG, en la que Bc es un catión biocompatible; cMBP es un péptido cíclico de unión a cMet de 17 a 30 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos (SEC-1) :

Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6; en la que X1 es Asn, His o Tyr; X2 es Gly, Ser, Thr o Asn; X3 es Thr o Arg; X4 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser; X5 es Ser o Thr;

X6 es Asp o Glu; y Cysa-d son cada uno restos de cisteína de manera que esos restos a y b así como c y d se ciclan para formar dos enlaces disulfuro distintos;

MIG

es un grupo inhibidor del metabolismo que es un grupo biocompatible que inhibe o suprime el metabolismo in vivo del péptido;

L es un grupo de engarce sintético de fórmula - (A) m- en la que cada A es independientemente -CR2-, -CR=CR-, -C≡C-, -CR2CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR (C=O) NR-, -NR (C=S) NR-, -SO2NR-, -NRSO2-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, un grupo cicloheteroalquileno C4-8, un grupo cicloalquileno C4-8, un grupo arileno C5-12, o un grupo heteroarileno C3-12, un aminoácido, un azúcar o un componente básico de polietilenglicol (PEG) monodisperso;

cada R se elige independientemente de entre H, alquilo C1-4, alquenilo C2-4, alquinilo C2-4, alcoxialquilo C1-4

o hidroxialquilo C1-4, m es un número entero de un valor de 1 a 20; n es un número entero de un valor de 0 ó 1; IM es un resto indicador de formación de imágenes ópticas adecuado para la formación de imágenes del cuerpo de los mamíferos in vivo usando luz de una longitud de onda del verde al infrarrojo cercano d.

60. 1.200 nm.

2. El agente de formación de imágenes según la reivindicación 1, en el que además de la SEC-1, el cMBP comprende adicionalmente un resto de Asp o Glu dentro de los 4 restos de aminoácidos del extremo terminal C o N del péptido cMBP, y - (L) nIM se funcionaliza con un grupo amino que se conjuga con la cadena lateral carboxilo de dicho resto de Asp o Glu para dar un enlace amida.

3. El agente de formación de imágenes según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que además de la SEC-1, el cMBP comprende un resto de Lys dentro de 4 restos de aminoácidos del extremo terminal C o N del péptido cMBP, y - (L) nIM se funcionaliza con un grupo carboxilo que se conjuga con la amina épsilon de la cadena lateral de dicho resto de Lys para dar un enlace amida.

4. El agente de formación de imágenes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cMBP comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC-2 o la SEC-3:

Ser-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6 (SEC-2) ; Ala-Gly-Ser-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6-Gly-Thr (SEC-3) .

5. El agente de formación de imágenes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que además de la 45 SEC-1, la SEC-2 o la SEC-3, cMBP comprende adicionalmente en el extremo terminal N o C un péptido de engarce que se elige de entre -Gly-Gly-Gly-Lys- (SEC-4) , -Gly-Ser-Gly-Lys- (SEC-PN0744 EP 5) o -Gly-Ser-Gly-Ser-Lys (SEC-6) .

6. El agente de formación de imágenes según la reivindicación 5, en el que cMBP tiene la secuencia de aminoácidos (SEC-7) :

Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys.

7. El agente de formación de imágenes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que IM es un colorante que tiene un máximo de absorbancia en el intervalo d.

60. 1.000 nm.

8. El agente de formación de imágenes según la reivindicación 7, en el que IM es un colorante de cianina.

9. El agente de formación de imágenes según la reivindicación 8, en el que el colorante de cianina es de Fórmula III:

en la que:

R1 y R2 son independientemente H o SO3M1, y por lo menos uno de R1 y R2 es SO3M1, en la que M1 es H o BC; R3 y R4 son independientemente alquilo C1-4 o carboxialquilo C1-6; R5, R6, R7 y R8 son independientemente grupos Ra; en la que Ra es alquilo C1-4, carboxialquilo C1-6 o - (CH2) kSO3M1, en la que k es un número entero de un valor de 3 ó 4;

con la condición de que el colorante de cianina tenga un total de 1 a 4 sustituyentes SO3M1 en los grupos R1, R2 y Ra.

10. El agente de formación de imágenes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que cMBP es tal como se define en la reivindicación 6, Z1 es acetilo y Z2 es una amida primaria, e IM es tal como se define en las reivindicaciones 3 y 9.

11. Una composición farmacéutica que comprende el agente de formación de imágenes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 junto con un portador biocompatible, en una forma adecuada para la administración a mamíferos.

12. Un procedimiento de preparación del agente de formación de imágenes según las reivindicaciones 1 a 10, que comprende una de las etapas (i) a (iv) :

(i) reacción de un péptido cMBP de fórmula Z1-[cMBP]-Z2 en la que Z1 es H y Z2 es un MIG con un compuesto de fórmula Y1- (L) n-[IM], para dar el agente de formación de imágenes de Fórmula I en la que [IM] se conjuga en la posición Z1;

(ii) reacción de un péptido cMBP de fórmula Z1-[cMBP]-Z2 en la que Z1=Z2=MIG y cMBP comprende un resto de Asp o Glu dentro de 4 restos de aminoácidos de los extremos terminales C o N del péptido cMBP, y todos los demás restos de Asp/Glu del péptido cMBP están protegidos, con un compuesto de fórmula Y2- (L) n-[IM], para dar el agente de formación de imágenes de Fórmula I en la que [IM] se conjuga en dicho resto de Asp o Glu del péptido cMBP;

(iii) reacción de un péptido cMBP de fórmula Z1-[cMBP]-Z3 en la que Z1 es MIG y Z3 es un grupo Z2 o un éster activado y todos los demás restos de Asp/Glu de los péptidos cMBP están protegidos, con un compuesto de formula Y2- (L) n-[IM], para dar el agente de formación de imágenes de Fórmula I en la que [IM] se conjuga en la posición Z2, (iv) reacción de un péptido cMBP de fórmula Z1-[cMBP]-Z2 en la que Z1=Z2=MIG y cMBP comprende una Lys dentro de 4 restos de aminoácidos del extremo terminal C o N del péptido cMBP, con un compuesto de formula Y1- (L) n-[IM], para dar el agente de formación de imágenes de Fórmula I en la que [IM] se conjuga en un resto de Lys del péptido cMBP; en la que Z1, cMBP, Z2, MIG, L, n e IM son tal como se define en la reivindicación 1, y Z3 es un grupo Z2 o un éster activado; Y1 es un grupo ácido carboxílico, éster activado, tiocianato o isotiocianato; Y2 es un grupo amino.

13. Un kit para la preparación de la composición farmacéutica según la reivindicación 11 que comprende el agente 45 de formación de imágenes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en una forma sólida estéril, de manera que tras la reconstitución con un suministro estéril del portador biocompatible tal como se define en la reivindicación 11, se produzca la disolución para dar la composición farmacéutica deseada.

14. Un procedimiento de formación de imágenes ópticas in vivo del cuerpo de los mamíferos que comprende el uso del agente de formación de imágenes según las reivindicaciones 1 a 10 o de la composición farmacéutica según la reivindicación 11 para obtener imágenes de los sitios de localización o sobreexpresión de cMet in vivo.

15. El agente de formación de imágenes según las reivindicaciones 1 a 10 o la composición farmacéutica según la

reivindicación 11 para su uso en un procedimiento de detección, determinación del estado, diagnóstico, monitorización de la progresión de la enfermedad o monitorización del tratamiento del cáncer colorrectal (CCR) del cuerpo de los mamíferos.