PARTÍCULAS QUIMÉRICAS VACÍAS SIMILARES A VIRUS DERIVADAS DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE LA BURSITIS INFECCIOSA (IBDV), PROCESO PARA SU PRODUCCIÓN Y APLICACIONES.

Partículas quiméricas vacías similares a virus derivadas del virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa(IBDV), proceso para su producción y aplicaciones Campo de la invención La invención se relaciona con la producción de partículas quiméricas similares a virus derivadas del virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV) y sus aplicaciones. Antecedentes de la invención Las partículas similares a virus son estructuras especializadas en el empaque y transporte de ácidos nucleicos y proteínas. Una característica general de las partículas similares a virus es su excelente capacidad para estimular la respuesta inmune del huésped. Estas propiedades hacen de las partículas similares a virus, agentes extremadamente interesantes para el desarrollo de sistemas de entrega intracelulares y para la generación de vacunas de subunidades. El uso de diferentes sistemas de expresión del gen ha ayudado en la producción de cápsides virales vacías o partículas similares a virus (VLPs) de varios virus, por ejemplo rotavirus (US 2003/0175301), retrovirus (US 6.602.705), parvovirus (US 6.458.362), etc. La manipulación genética de estos sistemas de expresión, a su vez permite la producción de VLPs que contienen secuencias de aminoácidos heterólogos a partir de proteínas diferentes de aquellas que forman la cápside viral nativa. Estas VLPs genéricamente se llaman VLPs heterotípicas, recombinantes o quiméricas (CVLPs), y han sido utilizadas principalmente para dos propósitos: (i) generación de vacunas multivalentes por medio de péptidos heterólogos inmunogenéticamente relevantes, y (ii) modificación del tropismo, por medio de la inserción de secuencias de aminoácidos involucradas en las interacciones ligando-receptor. El virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), que pertenece a la familia Birnaviridae, infecta varias especies de aves y es directamente responsable de la bursitis infecciosa, una severa enfermedad inmunosupresora que causa considerables pérdidas económicas en la industria avícola en todo el mundo. Las partículas del IBDV son icosaédricas con simetría T=13, carecen de envoltura y están formadas por una única capa proteica. Hasta ahora, los enfoques dirigidos a la obtención de un modelo atómico para las partículas del IBDV han fracasado. Por esta razón, la información disponible en su estructura se basa en modelos tri-dimensionales generados de las imágenes obtenidas por criomicroscopía electrónica del virus purificado y VLPs. Con base en estos estudios, se ha observado que la superficie externa de la partícula se forma por un entramado continuo de 260 trímeros de proteína VP2 (37 kDa) dispuestos en cinco diferentes conformaciones. El lado interno de las partículas contiene 200 trímeros de la proteína VP3 (29 kDa), estos últimos, independientemente uno del otro, se unen al área basal de los trímeros de VP2. Se ha sugerido que un tercer polipéptido, VP4 (28 kDa), también podría ser parte de las partículas, el cual se encuentra localizado en la base de los pentámeros que forman los ángulos de la estructura icosaédrica. Los polipéptidos VP2, VP3 y VP4 se producen a partir del procesamiento proteolítico de un polipéptido precursor con un tamaño de 109 kDa. Este precursor se procesa auto-catalíticamente, liberando los polipéptidos pVP2 (48 kDa), VP3 y VP4. El dominio de VP4, que se localiza en la región central de la poliproteína, pertenece a la familia de las Ion proteasas y es responsable del corte proteolítico. Los polipéptidos pVP2 y VP3 son directamente responsables del montaje de las cápsides. El producto de pVP2 sufre un último corte en su extremo C-terminal, antes de dar lugar a la forma madura de la proteína, VP2, que es la forma encontrada en las partículas purificadas. Este procedimiento de pVP2 es necesario para la correcta formación de las cápsides y requiere la presencia de VP3, aunque la proteasa responsable aún no ha sido identificada. La morfogénesis es un proceso vital del ciclo vírico que requiere de etapas sucesivas asociadas con las modificaciones en los polipéptidos precursores. Como resultado, los virus han desarrollado estrategias que permiten la secuencial y correcta interacción entre cada uno de sus componentes. Una de estas estrategias, frecuentemente utilizadas por los virus icosaédricos, consiste en el uso de polipéptidos de una poliproteína única como la base de sus componentes estructurales. En estos casos, el correcto procesamiento proteolítico de dicha poliproteína juega un papel crucial en el proceso de montaje. Este principio de ensamblaje de la cápside del IBDV, se ha demostrado en trabajos recientes (Fernández-Arias A et al. 1998. Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79:1047-1054). La expresión en células eucariotas del gen codificante de la poliproteína del IBDV da lugar a la formación de VLPs que son completamente indistinguibles, tanto morfológica como bioquímicamente, de los viriones de IBDV. También se ha observado que el ensamblaje de la cápside requiere solo la síntesis y el procedimiento correcto de la poliproteína viral y es independiente de la presencia del genoma viral o de otras proteínas codificadas por el genoma viral, tales como proteínas VP5 y VP1. 2   Hasta ahora, los resultados obtenidos de la expresión de genes de IBDV en diferentes sistemas recombinantes, han permitido concluir que: i) el proceso de ensamblaje es independiente de la presencia de material genético del virus, ii) sólo aquellos polipéptidos codificados por el gen de la poliproteína son necesarios para el ensamblaje, y iii) el ensamblaje requiere una interacción coordinada entre los polipéptidos de VP2 y VP3. Sin embargo, se desconoce si la interacción pVP2/VP3 se establece entre los dominios VP2 y VP3 de la poliproteína precursora incluso cuando no se ha modificado, o sí, por el contrario, esta interacción ocurre después de procesar el precursor. Además, la información actual no excluye la posibilidad de que VP4 pudiera jugar un papel relevante en la morfogénesis de la cápside. De hecho, han sido reveladas las VLPs del IBDV formadas por el ensamblaje de las proteínas VP2, VP3 y VP4 del IBDV (US 6,528,063; US 5,788,970 y JP 5194597). El trabajo desarrollado por los inventores de este trabajo, ha permitido establecer los sistemas para obtener las VLPs de IBDV mediante el uso de diferentes vectores de expresión eucarióticos. Estos vectores han sido utilizados para expresar la poliproteína del IBDV en la ausencia o presencia de ARN de polimerasa viral VP1. La caracterización bioquímica de VLPs purificadas muestra que contienen proteínas pVP2, VP2 y VP3 cuando sólo la poliproteína viral se expresa, y las proteínas pVP2, VP2, VP3 y VP1 cuando la poliproteína y el ARN de la polimerasa viral se expresan simultáneamente (Fernández-Arias A et al. 1998. Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79:1047-1054; Martinez-Torrecuadrada JL et al. 2000. Different architectures in the assembly of infectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells. Virology 278:322-331; Maraver A et al. 2003. The oligomerization domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of Virology 77:6438-49; Lombardo E et al. 1999. VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73:6973-6983). De hecho, el documento de patente WO 02/088339 revela las partículas del IBDV similares a virus formadas por el ensamblaje de proteínas quiméricas que comprenden la poliproteína del IBDV unida a un polipéptido en su extremo C-terminalarboxilo. Las CVLPs basadas solamente en la proteína pVP2 del IBDV, o en los fragmentos de ésta, fusionada a un polipéptido de interés, o su potencial uso como vacunas o como portadores de los productos de interés, no han sido descritas antes. Resumen de la invención La invención se enfrenta con el problema de proporcionar nuevas herramientas para vectorizar o incorporar en los portadores, productos de interés tales como moléculas con actividad biológica, por ejemplo fármacos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc. La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han observado que es posible obtener partículas quiméricas vacías similares a virus derivadas del IBDV, como resultado de la expresión de la proteína pVP2 del IBDV, o un fragmento de dicha proteína que es capaz de ensamblarse por sí mismo y forma dichas partículas similares a virus, las cuales son genéticamente... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión capaz de formar una partícula vacía similar a virus y que consiste en una región A que consiste en un fragmento de la proteína pVP2 del virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), que consiste en residuos de aminoácidos 1 a n, en donde "n" es un número entero entre 441 y 501, y una o dos regiones B que consisten en polipéptidos heterólogos, en donde dichos polipéptidos heterólogos no son polipéptidos IBDV nativos y dichos polipéptidos heterólogos contienen uno o más polipéptidos de interés útiles en vacunación, terapia y/o diagnóstico, y en donde dichas regiones B se unen a una región terminal de dicha región A. 2. Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha región A consiste en dicho fragmento de la proteína pVP2 del IBDV seleccionado de: (i) pVP2-441, que consiste en la secuencia de aminoácidos del residuo 1 al residuo 441 de la proteína pVP2 del IBDV de SEQ ID No. 16; (ii) pVP2-452, que consiste en la secuencia de aminoácidos del residuo 1 al residuo 452 de la proteína pVP2 del IBDV de SEQ ID No. 16; (iii) pVP2-456, que consiste en la secuencia de aminoácidos del residuo 1 y al residuo 456 de la proteína pVP2 del IBDV de SEQ ID No. 16; (iv) pVP2-466, que consiste en la secuencia de aminoácidos del residuo 1 al residuo 466 de la proteína pVP2 del IBDV de SEQ ID No. 16; (v) pVP2-476, que consiste en la secuencia de aminoácidos del residuo 1 al residuo 476 de la proteína pVP2 del IBDV de SEQ ID No. 16; (vi) pVP2-487, que consiste en la secuencia de aminoácidos del residuo 1 al residuo 487 de la proteína pVP2 del IBDV de SEQ ID No. 16; (vii) pVP2-494, que consiste en la secuencia de aminoácidos del residuo 1 al residuo 494 de la proteína pVP2 del IBDV de SEQ ID No. 16; y (viii) pVP2-501, que consiste en la secuencia de aminoácidos del residuo 1 al residuo 501 de la proteína pVP2 del IBDV de SEQ ID No. 16. 3. Proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde una región B se une a la región terminal amino de dicha región A 4. Proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde una región B se une a la región carboxilo terminal de dicha región A. 5. Proteína de fusión de la reivindicación 1, que comprende una región A y dos regiones B idénticas o diferentes, estando unida una de dichas regiones B al amino terminal de la región A, y estando unida la otra región B al arboxilo terminal de la región A. 6. Proteína de fusión de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha proteína de fusión comprende además un polipéptido espaciador localizado entre dichas regiones A y B. 7. Partícula quimérica vacía similar a virus que comprende al menos una proteína de fusión de las reivindicaciones 1 a 6. 8. Método para la producción de las partículas quiméricas vacías similares a virus de la reivindicación 7, que comprende el cultivo de una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión y la recuperación de dichas partículas quiméricas vacías similares a virus. 9. Método de la reivindicación 7 a 8, en donde dicha célula huésped es una célula de insecto. 10. Método de la reivindicación 7 a 8, en donde dicha célula huésped es una célula de levadura. 11. Composición farmacéutica que comprende las partículas quiméricas vacías similares a virus de la reivindicación 6 y un adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable. 28   12. Composición farmacéutica de la reivindicación 11, en donde dicha composición farmacéutica es una vacuna. 13. Vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la partícula quimérica vacía similar al virus de la reivindicación 7.             FIGURA 7   FIGURA 8   FIGURA 9   FIGURA 10       REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citadas en la descripción US 20030175301 A [0002] US 6602705 B [0002] US 6458362 B [0002] US 6528063 B [0009] US 5788970 A [0009] JP 5194597 B [0009] WO 02088339 A [0011] ES P200300751 [0114] ES P200400120 [0114] ES P200400121 [0114] Literatura no-patente citada en la descripción Fernández-Arias A et al. Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of viruslike particles. Journal of General Virology, 1998, vol. 79, 1047-1054 [0007] [0010] Martinez-Torrecuadrada JL et al. Different architectures in the assembly of infectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells. Virology, 2000, vol. 278, 322-331 [0010] Maraver A et al. The oligomerization domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of Virology, 2003, vol. 77, 6438-49 [0010] Lombardo E et al. VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology, 1999, vol. 73, 6973-6983 [0010] Zhang, Q. et al. Acta Virologica, 2002, vol. 46 (1), 1-9 [0017] [0036] [0115] van den Berg TP et al. Rev Sci Tech., 2000, vol. 19, 509-43 [0027] SánchezAB ; Rodriguez JF. 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