Nuevos sustratos enzimáticos derviados de fenoxazinona y su utilización como revelador en la detección de microorganismos con actividad peptidasa.

Sustrato enzimático cromógeno, caracterizado porque responde a la fórmula (I) siguiente:

en la que

- R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C1-C12, un grupo aralquilo de C6-C14, un grupo arilo, -COOH, -COOR' o -NR"R"',

- R2 representa un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo alquilo de C1-C12, -COOH o -COOR',

entendiéndose que al menos uno de entre R1 y R2 es un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno,

- R3 representa un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, -CN, -CONH2, -COOR' o -COR',

- R4, R5 y R6, cada uno independientemente, representan un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C1-C3, entendiéndose que al menos uno de entre R4, R5 y R6 es un átomo de hidrógeno,

- R' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C1-C6,

- R" y R"' representan, cada uno independientemente, un grupo alquilo de C1-C6, o bien R" y R"', junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico que contiene uno o más heteroátomos,

- A representa al menos un aminoácido, y

- X representa un agente de bloqueo o nada.

Nuevos sustratos enzimáticos derivados de fenoxazinona y su utilización como revelador en la detección de microorganismos con actividad peptidasa.

La presente invención se refiere a nuevos sustratos enzimáticos cromógenos para la detección de actividad peptidasa. Estos sustratos son utilizables en las aplicaciones que comprenden una etapa de hidrólisis enzimática que produce una señal físico-química, particularmente en microbiología, bioquímica, inmunología, biología molecular, histología, etc. Comparativamente a los sustratos existentes, la mayor parte únicamente fluorógenos, los sustratos cromógenos de la invención pueden utilizarse particularmente en medio gelificado para la detección de microorganismos, ya que producen una coloración que no se difunde en el medio de reacción, por lo tanto, concentrada a nivel de las colonias.

La invención también se refiere a medios de reacción que contienen dichos sustratos, a la utilización de los sustratos o de los medios para la detección de bacterias Gram negativas, Gram positivas y de levaduras que expresan una actividad peptidasa, y a procedimientos de utilización.

Se denomina en general aminopeptidasa a una enzima capaz de escindir mediante hidrólisis el grupo amida formado entre un acilo de aminoácido y una amina primaria, y se denomina peptidasa a una enzima capaz de escindir mediante hidrólisis el grupo amida formado entre el resto acilo de un péptido y una amina primaria. En la presente solicitud, el término "peptidasa" puede designar, según los casos, tanto una peptidasa como una aminopeptidasa, tal como se han definido anteriormente.

Los sustratos cromógenos enzimáticos para la detección de actividad peptidasa que no se difunden se describen y ya se conocen en el estado de la técnica. De este modo, dichos sustratos son abarcados por las solicitudes de patente WO98/04735 y WO99/38995 depositadas por la Solicitante. Sin embargo, estos sustratos presentan diferentes inconvenientes: su síntesis es difícil, la pureza es reducida y los rendimientos escasos. Además, para una utilización en medios de cultivo, es preciso definir una composición del medio muy precisa para observar un color.

Los únicos sustratos existentes que pueden utilizarse en medios sólidos para la detección de microorganismos en cultivos mixtos son sustratos derivados de acridina y se describen en la solicitud de patente PCT WO2004/069804 depositada por la Solicitante.

Se conocen moléculas derivadas de fenoxazinona por su capacidad para producir fluorescencia. Éstas pueden utilizarse:

- como indicadores ácido-básicos, como se describe por ejemplo en el documento Stuzka, V. et al., 1963, Collection Czech. Chem. Commun., 28, 1399-1407 o bien

- como marcadores fluorescentes, por ejemplo para seguir modificaciones de conformaciones de proteínas, como se describe en el documento J. et al., 2001, Analytical Chemistr y , 73 (13) , 2920-2928, o bien por ejemplo para la detección de microorganismos, como se describe en la patente US5.336.600. En este último caso, los compuestos descritos tienen como inconvenientes que solamente pueden utilizarse en medios líquidos y que la detección de los microorganismos, que se realiza mediante la demostración de un crecimiento bacteriano, se realiza mediante modificación del potencial de óxido-reducción (redox) . Por lo tanto, no hay ninguna especificidad con respecto a una actividad enzimática ni con respecto a un género o una especie bacteriana.

Ningún derivado de aminofenoxazinona descrito actualmente, y en particular ningún derivado de resorrufamina, se ha utilizado nunca como sustrato cromógeno enzimático utilizable en medio gelificado.

El documento DE10251894 describe compuestos y su utilización como sustratos enzimáticos cromógenos para la detección de actividad peptidasa. Los documentos US6235493, WO0142491 y Agban A et al (1990) , Annales Pharmaceutiques Françaises, vol. 48, no. 6, págs. 326-334 describen ensayos de detección de la actividad peptidasa de microorganismos. El documento WO2004101536 describe derivados de fenoxazinona y su aplicación para la detección de la actividad peptidasa de microorganismos.

Resumen de la invención: La invención, en su sentido más amplio, es tal como se define mediante las reivindicaciones.

De acuerdo con la presente invención, se proponen nuevos sustratos cromógenos enzimáticos para la detección de microorganismos que expresan una actividad peptidasa. La invención también se refiere a medios de reacción que contienen dichos sustratos, así como a la utilización de los sustratos o de los medios para la detección de actividades peptidasas, y a procedimientos de utilización.

En efecto, la Solicitante ha descubierto de manera sorprendente que era posible detectar microorganismos que expresan una actividad peptidasa mediante la utilización de nuevos derivados de fenoxazinona cromógenos que producen una coloración que no se difunde en el medio de reacción, por lo tanto concentrada a nivel de las colonias, quedando demostrada la actividad peptidasa mediante una modificación de la coloración de las colonias en el medio de cultivo.

Después de la siembra de los medios de reacción que contienen los sustratos de la invención con los microorganismos a ensayar, se observan colonias de incoloras a blancas cuando éstas no son capaces de hidrolizar el sustrato. Por el contrario, se observan colonias coloreadas cuando son capaces de hidrolizar el sustrato de la invención.

Los derivados de fenoxazinona de la invención son a la vez cromógenos y fluorógenos y tienen como ventaja una buena sensibilidad de detección. Además, la excitación y la emisión de fluorescencia se realizan en el espectro visible, de modo que la fluorescencia puede detectarse a simple vista y con iluminación normal.

De acuerdo con la invención, se entiende particularmente por arilo un anillo aromático de C6-C12, particularmente fenilo, bencilo, 1-naftilo o 2-naftilo. Lo mismo se aplica para la parte arilo de los grupos aralquilo. De este modo, el grupo alquilo del grupo aralquilo de C6-C14 es de C2-C8.

Se entiende por alquilo de Cx-Cy, un alquilo lineal o ramificado que tiene de x a y átomos de carbono, en el presente caso de 1 a 12 átomos de carbono, de 1 a 6 átomos de carbono, o de 1 a 3 átomos de carbono o de 2 a 8 átomos de carbono. Como ejemplo, pueden mencionarse metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo y dodecilo.

Por átomo de halógeno, se entiende cloro, bromo, yodo y flúor.

Por heteroátomo, se entiende un átomo diferente de un átomo de carbono, tal como por ejemplo O, N o S.

Los anillos heterocíclicos que pueden formar R" y R"' pueden ser de cualquier tamaño, pero preferentemente contienen de 5 a 7 miembros.

Los ejemplos de anillo heterocíclico comprenden el anillo de morfolina, piperazina, piperidina, pirrolidina e imidazolidina.

Los agentes de bloqueo de acuerdo con la invención comprenden cualquier agente de bloqueo conocido por el experto en la materia que es capaz de proteger a las aminas. Como ejemplo, pueden mencionarse t-butoxicarbonilo (N-tBOC) , 9-fluoreniloxicarbonilo, un agente de solubilización tal como succinilo, o bien un aminoácido no metabolizable, es decir no natural, tal como el ácido pipecólico.

Los agentes de bloqueo no están sistemáticamente presentes en los compuestos de la invención. En este caso, es decir cuando los compuestos de la invención no poseen ningún agente de bloqueo (X es nada) , los compuestos de la invención están en forma de sal, tal como cloruro, bromuro o trifluoroacetato.

Los aminoácidos que se representan mediante A en la fórmula (I) , son cualquier aminoácido conocido por el experto en la materia.

La presente invención se refiere a sustratos enzimáticos cromógenos de fórmula (I) :

en la que

- R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C1-C12, un grupo aralquilo de C6-C14, un grupo arilo, -COOH, -COOR' o -NR"R"',

- R2 representa un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo alquilo de C1-C12, -COOH o-COOR', entendiéndose que al menos uno de entre R1 y R2 es un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno,

- R3 representa un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, -CN, -CONH2, -COOR' o -COR',

- R4, R5 y R6, cada uno independientemente, representan un átomo de hidrógeno... [Seguir leyendo]

1. Sustrato enzimático cromógeno, caracterizado porque responde a la fórmula (I) siguiente:

en la que

- R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C1-C12, un grupo aralquilo de C6-C14, un grupo arilo, -COOH, -COOR' o -NR"R"',

- R2 representa un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo alquilo de C1-C12, -COOH o -COOR', entendiéndose que al menos uno de entre R1 y R2 es un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno,

- R3 representa un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, -CN, -CONH2, -COOR' o -COR',

- R4, R5 y R6, cada uno independientemente, representan un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C1-C3, entendiéndose que al menos uno de entre R4, R5 y R6 es un átomo de hidrógeno,

- R' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C1-C6,

- R" y R"' representan, cada uno independientemente, un grupo alquilo de C1-C6, o bien R" y R"', junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico que contiene uno o más heteroátomos,

- A representa al menos un aminoácido, y

- X representa un agente de bloqueo o nada.

2. Sustrato enzimático cromógeno de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 representa un grupo alquilo, preferentemente de C3-C6, y R2 representa un átomo de hidrógeno.

3. Sustrato enzimático cromógeno de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 representa un átomo de hidrógeno y R2 representa un grupo alquilo, preferentemente un grupo etilo o hexilo.

4. Sustrato enzimático cromógeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque R3, R4, R5 y R6 representan un átomo de hidrógeno.

5. Medio de reacción que comprende al menos un sustrato cromógeno enzimático, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en solitario o en combinación con al menos otro sustrato enzimático específico de una actividad enzimática diferente de la actividad peptidasa detectada por dicho sustrato como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Medio de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque es un medio de cultivo.

7. Medio de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque está en forma gelificada.

8. Utilización de un sustrato enzimático cromógeno como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o de un medio de reacción como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para la detección y/o la identificación y/o la cuantificación in vitro de microorganismos que expresan al menos una actividad peptidasa.

9. Procedimiento para la detección y/o la identificación y/o la cuantificación de microorganismos que expresan al menos una actividad peptidasa, caracterizado porque consiste en:

• disponer de un medio de reacción, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7,

• sembrar el medio con una muestra biológica a ensayar,

• dejar incubar, y

• revelar la presencia de al menos una actividad peptidasa en solitario o en combinación con al menos otra actividad enzimática diferente de esta misma actividad peptidasa.

10. Procedimiento para la diferenciación en bacterias de su pertenencia a los gérmenes Gram positivo o a los gérmenes Gram negativo, caracterizado porque consiste en:

• disponer de un medio de reacción, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 y en el que el sustituyente A del sustrato cromógeno es L-alanina,

• sembrar el medio con una muestra biológica a ensayar,

• dejar incubar, y

• revelar la presencia de al menos una variación de coloración sinónima de la presencia de un germen o 10 gérmenes Gram negativos.

11. Procedimiento para la detección de Pseudomonas aeruginosa, caracterizado porque consiste en:

• disponer de un medio de reacción, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 y en el que el sustituyente A del sustrato cromógeno es 1-alanina o piroglutamina,

• sembrar el medio con una muestra biológica a ensayar, 15 • dejar incubar, y

• revelar la presencia de al menos una variación de coloración sinónima de la presencia de un germen o gérmenes de Pseudomonas aeruginosa.