NUEVOS REACTIVOS DE OXIDACIÓN SOBRE SOPORTE, PROCEDIMIENTO PARA SU PREPARACIÓN Y UTILIZACIONES DE LOS MISMOS.

Nuevos reactivos de oxidación sobre soporte, procedimiento para su preparación y utilizaciones de los mismos. La presente invención se refiere a nuevos reactivos de oxidación sobre soporte, a los procedimientos para prepararlos y a su utilización para la formación de puentes disulfuro intramoleculares. La utilización de reactivos sobre soporte se está extendiendo rápidamente en química orgánica, en particular desde la automatización de la síntesis orgánica. Los reactivos sobre soporte son de gran utilización ya que, después de la reacción, pueden eliminarse del medio de reacción por simple filtración. Algunos pueden incluso reciclarse y reutilizarse. En este caso, es ventajoso observar que estos reactivos sobre soporte están precisamente comprendidos en la estrategia del desarrollo de larga duración y respeto al medio ambiente. Los reactivos sobre soporte son particularmente ventajosos para estimular reacciones intramoleculares. De hecho, son conocidos por dar lugar a un fenómeno de pseudodilución que permite minimizar polimerizaciones y utilizar cantidades mucho más pequeñas de disolventes. La síntesis de péptidos es la causa de la síntesis sobre soporte. Actualmente está muy automatizada y el alargamiento de la cadena peptídica se realiza generalmente sobre un soporte sólido. Sin embargo, en determinados casos, las etapas finales de síntesis y tratamiento se llevan a cabo en solución, después del desacoplamiento de la cadena peptídica del soporte sólido. Este es en particular el caso de la formación de puentes disulfuro. Debe apreciarse la gran ventaja biológica de puentes disulfuro en el campo de los péptidos. La actividad biológica de un péptido está relacionada con su estructura primaria, es decir con la serie de aminoácidos, y también con su estructura tridimensional. Esta última está condicionada por la presencia, en la misma cadena peptídica, de interacciones variadas tales como enlaces de hidrógeno o interacciones hidrófobas, y también por la existencia de enlaces covalentes tales como los implicados en puentes disulfuro. La presencia de estos puentes disulfuro permitirá al péptido estructurarse en el espacio y adoptar una configuración que permite adquirir una actividad biológica esencial para su participación en procesos fisiológicos variados. Normalmente, la formación intramolecular de puentes disulfuro requiere condiciones de gran dilución y la presencia de un oxidante. Snow et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1975, 64(1), 441, dan a conocer la oxidación de grupos -SH a disulfuros por sulfóxidos. El sulfóxido de dimetilo (SODM) es uno de los reactivos oxidantes más frecuentemente utilizado para esto. Este producto tiene la ventaja de ser soluble en agua. Uno de sus principales inconvenientes es su eliminación del medio de reacción, lo que requiere evaporación a intenso vacío o liofilizaciones repetidas. Además, el sulfuro de dimetilo generado durante la reacción es volátil y tóxico. La utilización de reactivos de oxidación sobre soporte se ha considerado posteriormente para la síntesis convencional de péptidos bioactivos, pero también para la síntesis automática de bancos químicos de péptidos que llevan puentes disulfuro. Éstos presentan numerosas ventajas: - ya que la formación de puentes disulfuro es una reacción intramolecular, estos reactivos sobre soporte evitan actuar en condiciones muy diluidas, minimizando el volumen de disolvente y permitiendo la miniaturización y la utilización de pocillos robot con un volumen que con frecuencia es pequeño; - los reactivos sobre soporte permiten obtener los puentes en los péptidos y las proteínas en condiciones muy suaves y simples sin utilización de oxidantes tóxicos, malolientes y volátiles. - los reactivos de oxidación sobre soporte pueden eliminarse sencillamente y no requieren ninguna liofilización o evaporación, lo que facilita en gran medida la automatización; - los reactivos de oxidación sobre soporte pueden reciclarse y reoxidarse después de la utilización. Hasta la fecha se han descrito pocos reactivos de oxidación sobre soporte que sean eficaces para la formación de puentes disulfuro. El ácido 6-(metilsulfinil)hexanoico, fijado sobre un soporte sólido de tipo polietilenglicol-poliestireno (PEG-PS), es un buen sustituto del SODM para la síntesis de cetonas por reacción de oxidación de Swern, pero no se ha utilizado para la formación de enlaces disulfuro (por ejemplo: Liu, Vederas, J. Org. Chem., 1996, 61, 7856; Choi, Toy, Tetrahedron, 2003, 59, 7171). Únicamente el reactivo de Ellmann (ácido 5,5-ditiobis (2-nitrobenzoico o DTNB), desarrollado inicialmente para la medición de la concentración de los tioles libres, ha sido adaptado para la formación de puentes disulfuro, como un reactivo de soporte (J. Peptide Res 63, 2004, p. 303-312). Permanece, sin embargo, de fabricación costosa e ineficaz relativamente comparado un método de oxidación convencional en solución utilizando SODM. 2 E07765429 11-01-2012   Por lo tanto continúan resultando todavía necesarios nuevos reactivos de oxidación sobre soporte, que son por lo menos tan eficaces como los reactivos utilizados en solución, son de fácil utilización y son económicos. Se ha desarrollado la síntesis y la utilización de nuevos reactivos de oxidación sobre un soporte sólido y soluble, capaz de favorecer la formación de puentes disulfuro, en particular en péptidos. Estos reactivos pueden utilizarse en la síntesis convencional de péptidos con puentes disulfuro, pero también para la síntesis paralela de bancos de péptidos (por ejemplo, en placas de 96 ó 384 pocillos). Estos reactivos son fáciles de utilizar y producen productos de oxidación en condiciones mucho mejores que los reactivos existentes. Además, su coste, y la facilidad con la que se sintetizan y utilizan les hace reactivos elegidos para la formación de puentes disulfuro en péptidos. Estos reactivos están constituidos por una serie de metioninas oxidadas injertadas en un soporte sólido o líquido. La presente invención se refiere por lo tanto a un reactivo de oxidación de fórmula (I): en la que, R representa un átomo de hidrógeno o un grupo protector de función amina, Met representa un resto de metionina de fórmula [Met(O)k] representa un resto de metionina oxidado de fórmula representa un soporte sólido o soluble utilizado en síntesis orgánica, X representa un radical procedente de una función de tipo amina, hidroxilo o halógeno, capaz de anclar la metionina, entendiéndose que esta función que puede anclar la metionina puede separarse del soporte mediante un miembro funcionalizado o un separador, y n está comprendido entre 2 y menor de 10000, y k es 1 ó 2, o n es igual a 1 y k es igual a 2. En la presente invención, la expresión grupo protector de función amina hace referencia a cualquier sustituyente que proteja el grupo amina de la cadena peptídica frente a reacciones indeseadas. Los diversos grupos que están comprendidos en esta definición son ampliamente conocidos y están descritos, por ejemplo, en Protective Groups In Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 1981. De manera no limitativa, puede mencionarse la 3 E07765429 11-01-2012   protección de la función amina en forma de carbamatos, de amidas, de derivados N-alquilados, de aminoacetales, de derivados N-bencílicos, de iminas o de enaminas. Por lo tanto, entre los grupos protectores, pueden mencionarse los grupos alquilcarbonilo (C1-C6) lineal o ramificado, alcoxicarbonilo (C1-C6) lineal o ramificado, alqueniloxicarbonilo (C2-C6) lineal o ramificado, alquiniloxicarbonilo (C2-C6) lineal o ramificado, ariloxicarbonilo, arilalquilo (C1-C6) lineal o ramificado, arilcarbonilo, arilsulfonilo, arilaminocarbonilo o alquiilaminocarbonilo (C1-C6) lineal o ramificado, permitiéndose que cada de estos grupos sea sustituido con uno o más átomos de halógeno o grupos hidroxilo, amino o mono- o dialquilamino (C1-C6) lineal o ramificado. A modo de ejemplo, se mencionan los grupos acetilo, benzoílo, fenilsulfonilo, terc-butiloxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (Z), para-metoxibenciloxicarbonilo, paranitrobenciloxicarbonilo, tricloroetoxicarbonilo (TROC), aliloxicarbonilo (Alloc), 9-fluorometoxicarbonilo (Fmoc), trifluoroacetilo y grupos bencil carbamato. En un aspecto preferido de la invención, cuando representa un grupo protector de función amina, el grupo R se seleccionará de entre los grupos alquilcarbonilo (C1-C6) lineal o ramificado, alquiloxicarbonilo (C1-C6) lineal o ramificado, alqueniloxicarbonilo (C1-C6) lineal o ramificado, alquiniloxicarbonilo (C1-C6) lineal o ramificado y ariloxicarbonilo, permitiéndose en cada de estos grupos ser sustituidos con uno o más átomos de halógeno o grupos hidroxilo, amino o mono- o dialquilamino (C1-C6) lineales o ramificado. Pueden mencionarse, por ejemplo, los grupos acilo,... [Seguir leyendo]

R representa un átomo de hidrógeno o un grupo protector de función amina, seleccionado ventajosamente de entre los grupos alquilcarbonilo (C1-C6) lineal o ramificado, alquiloxicarbonilo (C1-C6) lineal o ramificado, alqueniloxicarbonilo (C2-C6) lineal o ramificado, alquiniloxicarbonilo (C2-C6) lineal o ramificado y ariloxicarbonilo, resultando posible para cada de estos grupos estar sustituido con uno o más átomos de halógeno o grupos hidroxilo, amino o mono- o dialquilamino (C1-C6) lineales o ramificados, en particular seleccionados de entre un átomo de hidrógeno y grupos acilo, acetilo, benciloxicarbonilo, terc-butiloxicarbonilo y 9-fluorenilmetiloxicarbonilo. Met representa un resto de metionina de fórmula [Met(O)k] representa un resto de metionina oxidado de fórmula representa un soporte sólido o soluble utilizado en síntesis orgánica, seleccionado ventajosamente de entre soportes gelatinosos o macroporosos que presentan una matriz con una base de poliestireno, poliamida, polietilenglicol o de compuesto, resultando posible para dichos soportes encontrarse en forma de perlas, de soportes recubiertos de película tales como anillos o linternas, de tapones o de soportes solubles no reticulados y resultando posible para dicha matriz estar funcionalizada o no funcionalizada con un miembro funcionalizado, en particular una resina sin un miembro funcionalizado o una resina funcionalizada tales como resinas de clorometil-poliestireno, alcohol benciloxibencílico poliestireno, aminometil-poliestireno o metilbencihidrilamina-poliestireno, o resinas injertadas con un miembro funcionalizado seleccionado de entre la amida de Rink, clorotritilo, hidroximetilbencilacetamida, amida de Sieber, aminometil-3,5-dimetoxifenoxialquilo, aminometil-3dimetoxifenoxialquilo, hidroximetil-3,5-dimetoxifenoxialquilo e hidroximetil-3-dimetoxifenoxialquilo. X representa un radical procedente de una función de tipo amina, hidroxilo o halógeno, que puede anclar la metionina, entendiéndose que esta función que puede anclar la metionina puede separarse del soporte mediante un miembro funcionalizado o un separador, n está comprendido entre 2 y menos de 10.000, y k es 1 ó 2, o n es igual a 1 y k es igual a 2. 2. Utilización de un reactivo de oxidación según la reivindicación 1, para la formación de puentes disulfuro 14 E07765429 11-01-2012   intramoleculares, ventajosamente en péptidos y/o proteínas, en particular para la preparación de una peptidoteca que comprende por lo menos un puente disulfuro intramolecular, por síntesis en paralelo de alto rendimiento. 3. Procedimiento para la preparación de un reactivo de oxidación según la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de fórmula (II) en la que R, n, y X son como se definieron en la reivindicación 1, se somete a una reacción de oxidación, para proporcionar el compuesto de fórmula (I): en la que R, n, k y X son como se definieron en la reivindicación 1. 4. Procedimiento de preparación según la reivindicación 3, caracterizado porque el compuesto de fórmula (II) se prepara a partir del compuesto de fórmula (III): en la que R es como se definió en la reivindicación 1, R-[Met]-OH (III) por reacción con un soporte de fórmula HX- , en la que X y tienen el mismo significado que en la reivindicación 1, para proporcionar el compuesto de fórmula (IV): en la que R, X y son como se definieron anteriormente, siendo dicho compuesto de fórmula (IV), después de la desprotección por escisión del grupo R, sometido a una serie de reacciones con un compuesto de fórmula (III): en la que R es como se definió anteriormente, R-[Met]-OH (III) repitiéndose la reacción n-1 veces para proporcionar un compuesto de fórmula (II): en la que R, X y son como se definieron anteriormente, sobreentendiéndose que el grupo protector R puede eliminarse y/o modificarse en cualquier momento de la síntesis dependiendo de los reactivos utilizados. 5. Procedimiento de preparación según la reivindicación 3, caracterizado porque el compuesto de fórmula (II) se prepara a partir del N-carboxianhídrido de fórmula (V): E07765429 11-01-2012   por polimerización en presencia de un soporte de fórmula HX- , en la que X y tienen el mismo significado que en la reivindicación 1, en un disolvente tal como THF, durante un periodo de entre 12 y 48 horas, para proporcionar un compuesto de fórmula (II): un análogo del compuesto de fórmula (II) en la que R representa un átomo de hidrógeno, siendo posible que éste último se sustituya con un grupo protector, para proporcionar un compuesto de fórmula (II) tal como se definió en la reivindicación 3. 6. Procedimiento para la preparación de un reactivo de oxidación según la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de fórmula (VI): R-[Met(O)k]-OH (VI) en la que R y k son como se definieron en la reivindicación 1, se condensa con un soporte de fórmula HX- , en la que X y tienen el mismo significando que en la reivindicación 1, para proporcionar un compuesto de fórmula (VII): en la que R, X k y son como se definieron anteriormente, siendo dicho compuesto de fórmula (VII), después de la desprotección por escisión del grupo R, sometido a una serie de reacciones con un compuesto de fórmula (VI): en la que R es como se definió anteriormente, R-[Met(O)]-OH (VI) mediante un procedimiento convencional de acoplamiento de péptidos, en presencia de un agente de acoplamiento, repitiéndose la reacción n-1 veces, para proporcionar un compuesto de fórmula (I) como se definió en la reivindicación 1. 7. Procedimiento para la preparación de un reactivo de oxidación según la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de fórmula (IX): en la que k es como se definió en la reivindicación 1, se polimeriza en presencia de un soporte de fórmula HX- , en la que X y tienen el mismo significado que en la reivindicación 1, en un disolvente tal como THF, durante un periodo de entre 12 y 48 horas, para proporcionar un compuesto de fórmula (I'): 16 E07765429 11-01-2012   en la que n, k, X y tienen el mismo significado que anteriormente, estando la parte del terminal N del compuesto (I') protegida con un grupo R, para proporcionar un compuesto de fórmula (I) como se definió en la reivindicación 1. 8. Procedimiento para preparar un reactivo de oxidación según la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de fórmula (X): R-[Met(O)k]n-OH (X) en la que R, n y k son como se definieron en la reivindicación 1, reacciona con un soporte de fórmula HX- , en la que X y presentan el mismo significado que en la reivindicación 1, para proporcionar el compuesto de fórmula (I) como se definió en la reivindicación 1. 9. Procedimiento de preparación según la reivindicación 8, caracterizado porque el compuesto de fórmula (X) se prepara mediante una serie de reacciones constituidas por la condensación del compuesto de fórmula (III'): H-[Met]-OR' (III') en la que R' representa un grupo alquilo (C1-C6) lineal o ramificado, alquenilo (C2-C6) lineal o ramificado, bencilo, carboxiamidometilo o éster de amida bencihidril glicol, con un compuesto de fórmula (III): en la que R es como se definió anteriormente, R-[Met]-OH (III) por medio de un procedimiento convencional de acoplamiento de péptidos, en presencia de un agente de acoplamiento, repitiéndose la reacción n-1 veces, para proporcionar, después de la protección de la función del terminal C, un compuesto de fórmula (XI): R-[Met]n -OR' (XI) en la que R, R' y n son como se definieron anteriormente, sobreentendiéndose que R es diferente de un átomo de hidrógeno, siendo dicho compuesto de fórmula (XI) sometido a una reacción de oxidación, seguida de una reacción de desprotección por escisión del grupo R', para proporcionar un compuesto de fórmula (X) como se definió en la reivindicación 1. 10. Procedimiento de preparación según la reivindicación 9, caracterizado porque el compuesto de fórmula (XI) se prepara a partir del N-carboxianhídrido de fórmula (V): dejándose dicho compuesto de fórmula (V) al aire libre sin disolvente durante 2 días, para proporcionar, por medio de una reacción de polimerización espontánea iniciada por la humedad del aire, el compuesto de fórmula (XI'): H-[Met]n-OH (XI') un análogo del compuesto de fórmula (XI) para el que R y R' representan cada uno un átomo de hidrógeno, siendo posible que este último sea sustituido por un grupo protector, para proporcionar un compuesto de fórmula (XI) como 17 E07765429 11-01-2012   se definió en la reivindicación 9. 11. Procedimiento de preparación según la reivindicación 8, caracterizado porque el compuesto de fórmula (X) se prepara por policondensación del compuesto de fórmula (VI'): H-[Met(O)k]-OR' (VI') en la que R' representa un grupo alquilo (C1-C6) lineal o ramificado, alquenilo (C2-C6) lineal o ramificado, bencilo, carboxiamidometilo o éster de amida bencihidril glicol, y k es como se definió en la reivindicación 1, con un compuesto de fórmula (VI): R-[Met(O)k]-OH (VI) en la que R y k son como se definieron en la reivindicación 1, por medio de un procedimiento convencional de acoplamiento de péptidos, en presencia de un agente de acoplamiento, repitiéndose la reacción n-1 veces, para proporcionar un compuesto de fórmula (X), después de la desprotección por escisión del grupo R'. 12. Procedimiento de preparación según la reivindicación 8, caracterizado porque el compuesto de fórmula (X) se prepara por polimerización del N-carboxianhídrido de fórmula (IX): en la que k es como se definió anteriormente, que se deja al aire libre sin disolvente durante 2 días, iniciándose la reacción de polimerización espontánea por la humedad en el aire, para proporcionar un compuesto de fórmula (X'): en la que n y k son como se definieron anteriormente, H-[Met(O)k]n-OH (X') cuya parte del terminal N está protegida con un grupo R, para proporcionar un compuesto de fórmula (X) como se definió anteriormente. 13. Reactivo de oxidación de fórmula en la que Ac representa acetilo, n es un número entero seleccionado de 1 a 9, representa una resina de amida de Rink-poliestireno o una resina de polietilenglicol-poliestireno o una resina de poliamida-polietilenglicol-dimetilacrilamida. 14. Reactivo de oxidación según la reivindicación I de fórmula 18 E07765429 11-01-2012   en la que Ac representa acetilo y representa una resina de polietilenglicol-poliestireno. 15. Reactivo de oxidación según la reivindicación I de fórmula en la que Ac representa acetilo y representa una resina de amida de Rink-poliestireno. 16. Reactivo de oxidación según la reivindicación I de fórmula en la que Ac representa acetilo y representa una resina de poliamida-polietilenglicol-dimetilacrilamida. 19 E07765429 11-01-2012