Nivel de expresion de pro-EPIL en una muestra biológica como biomarcador del cáncer de testículo, particularmente en combinación con los biomarcadores HCGbeta y AFP.

Procedimiento in vitro para la detección y/o clasificación de un cáncer de testículo en un individuo,

que comprende la etapa que consiste en determinar el nivel de expresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL en una muestra biológica aislada de dicho individuo, en el que la sobreexpresión de dicho gen que codifica el péptido pro-EPIL indica la presencia de un cáncer de testículo y/o de una clase de tumor testicular de células germinales, preferentemente un cáncer de testículo y/o una clase de tumor testicular de células germinales seminomatosos o no seminomatosos.

Nivel de expresión de pro-EPIL en una muestra biológica como biomarcador del cáncer de testículo, particularmente en combinación con los biomarcadores HCGBeta y AFP.

La presente invención se refiere a la utilización del nivel de expresión del gen de pro-EPIL como biomarcador para el diagnóstico del cáncer de testículo, particularmente de un tumor testicular de células germinales. La presente invención también se refiere a un método in vitro para la detección y/o clasificación de un cáncer de testículo en un individuo, que comprende una etapa de determinación del nivel de expresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL en una muestra biológica, particularmente en combinación con la determinación de la subunidad beta ( -HCG y la alfa-fetoproteína AFP humana. La invención también se refiere a un kit o soporte sólido que comprende ácidos nucleicos o anticuerpos que pueden determinar la presencia o el nivel de expresión de estos tres marcadores biológicos.

El tratamiento de pacientes que padecen cáncer de testículo es un éxito de la oncología moderna, pues más del 90 por ciento de los pacientes con diagnóstico reciente de tumores de células germinales se curan y la tasa de mortalidad por cáncer de testículo ha disminuido aproximadamente 70% en los Estados Unidos y Europa Occidental desde la década de los setenta1-3. Este éxito se debe a dos importantes avances en el tratamiento de estas neoplasias: la introducción de quimioterapia combinada con cisplatino, que mejoró espectacularmente la tasa de curación, y la introducción simultánea de marcadores tumorales séricos, concretamente la gonadotropina coriónica humana (HCG) , su subunidad beta libre (Ã?-HCG) y la alfa-fetoproteína (AFP) . Estos marcadores tumorales facilitan el diagnóstico y tienen un papel importante en la evaluación de la respuesta al tratamiento y en el seguimiento de la remisión4. La lactato-deshidrogenasa (LDH) también es un producto de los tumores de células germinales, pero constituye un marcador tumoral menos específico.

Un factor que afecta al pronóstico es el retraso en el diagnóstico de los tumores testiculares, hecho que afecta al estadio de la enfermedad y, por lo tanto, a su pronóstico. En los últimos veinte años, se ha acentuado la tendencia hacia la reducción de este retraso diagnóstico5. Sin embargo, los recientes resultados de un amplio estudio poblacional ponen de manifiesto que un retraso diagnóstico prolongado está asociado a una menor supervivencia de los pacientes que padecen tumores no seminomatosos6. Por otro lado, la incidencia mundial del cáncer de testículo ha aumentado más del doble en los últimos 40 años6. Recientemente, su incidencia ha aumentado prácticamente en todos los países industrializados7. A pesar de los avances alcanzados hace 30 años, en los últimos años la disminución de la tasa de mortalidad se ha empezado a frenar en Europa, Estados Unidos y Japón, lo que indica el posible acercamiento a una asíntota en la mortalidad por cáncer de testículo3. Los pacientes que padecen un estadio avanzado de la enfermedad tienen que ser tratados con pautas quimioterapéuticas que presentan una toxicidad importante y algunos de ellos no responden al tratamiento.

En este contexto, valdría la pena reducir aún más el retraso diagnóstico y seguir mejorando las modalidades terapéuticas para los tumores testiculares con el fin de reducir la aplicación de este tipo de tratamientos y las molestias derivadas de su toxicidad. El desarrollo de nuevos biomarcadores puede contribuir a alcanzar este objetivo.

Este es el objeto de la presente invención.

Se ha demostrado que se puede utilizar el péptido pro-EPIL, o fragmentos específicos del mismo, como biomarcador tumoral para la detección y/o clasificación de un cáncer de testículo en un individuo, particularmente una clase de tumor testicular de células germinales.

El péptido EPIL está codificado por el gen insulinoide 4 (INSL4) . Dicho gen se ha identificado mediante el cribado de una biblioteca de ADNc de placenta humana de primer trimestre. El gen INSL4 está muy expresado en la placenta temprana y, salvo una débil expresión en los tejidos uterinos normales, no se ha detectado expresión de transcripciones de INSL4 en ningún otro tejido normal examinado hasta el momento8. El péptido insulinoide de placenta temprana (EPIL) codificado por el gen insulinoide 4 es un miembro de la familia génica de los insulinoides, que comprende la insulina, la relaxina (RLX) , los factores de crecimiento insulinoides I y II (IGF I e IGF II) , el péptido insulinoide de Leydig (LEY I-L) codificado por el gen INSL3 y los péptidos codificados por los genes INSL5 e INSL6.

El EPIL es un polipéptido de 139 aminoácidos que se sintetiza como preprohormona y está caracterizado por un péptido señal, una cadena B, un péptido C de conexión y una cadena A terminal (figura 1) . Se ha puesto de manifiesto en la placenta que las células del trofoblasto traducen los ARNm del INSL4 en péptidos pro-EPIL inmunorreactivos que comprenden las cadenas B, C y A9. En un principio, el péptido pro-EPIL se detectó en el líquido amniótico y el suero materno durante el embarazo normal, y el patrón de excreción del mismo era parecido al de la Ã?-HCG, lo que sugirió vías de regulación comunes10.

se ha demostrado que el péptido pro-EPIL (PEP) está expresado y secretado por los tumores testiculares de células germinales (TCGT) . Se ha investigado la expresión sérica y celular de PEP en pacientes con cáncer de testículo, lo que ha puesto de manifiesto que el PEP es un nuevo biomarcador que proporciona información adicional con respecto a la obtenida gracias a la Ã?-HCG y la AFP.

De este modo, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para la detección y/o clasificación de un cáncer de testículo en un individuo, que comprende una etapa de determinación del nivel de expresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL en una muestra biológica aislada de dicho individuo, en el que la sobreexpresión de dicho gen que codifica el péptido pro-EPIL indica la presencia de un cáncer de testículo y/o una clase de tumor testicular de células germinales.

En una forma de realización preferida, el procedimiento según la presente invención comprende además una etapa de determinación del nivel de expresión de por lo menos un gen seleccionado entre el grupo formado por los genes que codifican la gonadotropina humana HCG, su subunidad beta Ã?-HCG y la y alfa-fetoproteína humana AFP en una muestra biológica aislada de dicho individuo, en el que la sobreexpresión de por lo menos uno de dichos genes que codifican la HCG, su subunidad beta Ã?-HCG o la AFP humana indica la presencia de un cáncer de testículo y/o una clase de tumor testicular de células germinales.

En una forma de realización más preferida, dicho cáncer de testículo y/o clase de tumor testicular de células germinales es seminomatoso o no seminomatoso.

Los métodos de determinación del nivel de expresión de los genes que codifican el pro-EPIL humano, la HCG humana o su subunidad Ã?-HCG y la AFP humana en una muestra biológica aislada de dicho individuo son bien conocidos por el experto en la materia.

En una forma de realización más preferida, en el procedimiento según la presente invención, la presencia de una sobreexpresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL, una sobreexpresión del gen que codifica la Ã?-HCG y una sobreexpresión del gen que codifica la alfa-fetoproteína AFP en una muestra biológica aislada de dicho individuo indica la presencia de un cáncer de testículo y/o una clase de tumor testicular de células germinales no seminomatoso.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de identificación de un compuesto candidato para un agente farmacológico útil en el tratamiento del cáncer de testículo, particularmente de un tumor testicular de células germinales, que comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto un individuo mamífero no humano que presenta cáncer de testículo, particularmente un tumor testicular de células germinales, con un agente farmacológico candidato;

b) determinar el nivel de expresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL en una muestra biológica aislada de dicho individuo;

c) opcionalmente, determinar además el nivel de expresión de por lo menos un gen seleccionado entre el grupo formado por los genes que codifican la HCG, su subunidad Ã?-HCG y la AFP humana en una... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento in vitro para la detección y/o clasificación de un cáncer de testículo en un individuo, que comprende la etapa que consiste en determinar el nivel de expresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL en una muestra biológica aislada de dicho individuo, en el que la sobreexpresión de dicho gen que codifica el péptido pro-EPIL indica la presencia de un cáncer de testículo y/o de una clase de tumor testicular de células germinales, preferentemente un cáncer de testículo y/o una clase de tumor testicular de células germinales seminomatosos o no seminomatosos.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento comprende además una etapa de determinación del nivel de expresión de por lo menos un gen seleccionado entre el grupo constituido por los genes que codifican la gonadotropina humana HCG, su subunidad beta Ã?-HCG y la alfa-fetoproteína AFP humana en una muestra biológica aislada de dicho individuo, en el que la sobreexpresión de por lo menos uno de dichos genes que codifican la HCG, su subunidad beta Ã?-HCG o la AFP humana indica la presencia de un cáncer de testículo y/o una clase de tumor testicular de células germinales.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho procedimiento comprende además una etapa de determinación del nivel de expresión de los genes que codifican la HCG, o su subunidad Ã?-HCG, y la AFP humana en una muestra biológica aislada de dicho individuo, en el que la sobreexpresión de por lo menos uno de dichos genes que codifican la HCG, o su subunidad beta Ã?-HCG, o la AFP humana, indica la presencia de un cáncer de testículo y/o una clase de tumor testicular de células germinales.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la presencia de una sobreexpresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL, una sobreexpresión del gen que codifica la Ã?-HCG y una sobreexpresión del gen que codifica la alfa-fetoproteína AFP en una muestra biológica aislada de dicho individuo indica la presencia de un cáncer de testículo y/o una clase de tumor testicular de células germinales no seminomatosos.

5. Procedimiento de identificación de un compuesto candidato para un agente farmacológico útil en el tratamiento del cáncer de testículo, particularmente de un tumor testicular de células germinales, que comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto un individuo mamífero no humano que presenta cáncer de testículo, particularmente un tumor testicular de células germinales, con un agente farmacológico candidato;

b) determinar el nivel de expresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL en una muestra biológica aislada de dicho individuo;

c) opcionalmente, determinar además el nivel de expresión de por lo menos un gen seleccionado entre el grupo constituido por los genes que codifican la HCG, su subunidad Ã?-HCG y la AFP humana en una muestra biológica aislada de dicho individuo, en el que una disminución de la cantidad de prueba de expresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL y, opcionalmente, una disminución de la expresión del gen determinada en la etapa c) indica que el agente farmacológico candidato es un compuesto potencial para un agente farmacológico útil en el tratamiento del cáncer de testículo, particularmente de un tumor testicular de células germinales.

6. Procedimiento para evaluar el efecto en un individuo de un tratamiento del cáncer de testículo, particularmente de un tumor testicular de células germinales, que comprende las etapas siguientes:

a) determinar el nivel de expresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL en una muestra biológica aislada de dicho individuo;

b) determinar un segundo nivel de expresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL en una muestra biológica aislada de dicho individuo;

c) comparar las primera y segunda cantidades de nivel de expresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL en una muestra biológica aislada de dicho individuo;

en el que una disminución del nivel de expresión del gen que codifica el péptido pro-EPIL en la segunda muestra biológica aislada de dicho individuo indica la regresión de dicho cáncer de testículo, particularmente un tumor testicular de células germinales.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el nivel de expresión se determina mediante la detección de la presencia, la ausencia o el nivel de ARNm transcrito de dicho gen o de polipéptido codificado por dicho gen, o un fragmento específico del mismo.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho polipéptido se detecta o cuantifica por análisis de transferencia Western, cromatografía, inmunoensayo o ensayo inmunohistoquímico.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la muestra biológica obtenida del individuo se selecciona entre el grupo que comprende sangre completa, suero o plasma sanguíneos, biopsia del tumor o combinaciones de los mismos.

10. Kit para la detección y/o clasificación de un cáncer de testículo, particularmente un tumor testicular de células germinales, que comprende: a) un anticuerpo dirigido específicamente contra el péptido pro-EPIL;

b) un anticuerpo dirigido específicamente contra el polipéptido HCG o su subunidad Ã?-HCG; y c) un anticuerpo dirigido específicamente contra el polipéptido AFP humano.

11. Kit para la detección y/o clasificación de un cáncer de testículo, particularmente un tumor testicular de células germinales, que comprende: a) un conjunto de cebadores que pueden ampliar específicamente el ARN o ADNc del pro-EPIL; y b) un conjunto de cebadores que pueden ampliar específicamente el ARN o el ADNc del grupo constituido por la

HCG, su subunidad Ã?-HCG; y c) un conjunto de cebadores que pueden amplificar el ARN o ADNc de la alfa-fetoproteína AFP humana.

12. Kit para la detección y/o clasificación de un cáncer de testículo, particularmente un tumor testicular de células germinales, constituido por: a) una sonda nucleica que puede hibridarse específicamente con el ARN del pro-EPIL; b) una sonda nucleica que puede hibridarse específicamente con el ARN de la gonadotropina HCG humana o su

subunidad beta Ã?-HCG; y c) una sonda nucleica que puede hibridarse específicamente con el ARN de la alfa-fetoproteína AFP humana.

13. Matriz de moléculas de ácido nucleico en fase sólida para la detección y/o clasificación de un cáncer de testículo, particularmente un tumor testicular de células germinales, que comprende:

a) una molécula de ácido nucleico que puede hibridarse específicamente con el ARN del pro-EPIL;

b) una molécula de ácido nucleico que puede hibridarse específicamente con el ARN de la gonadotropina HCG humana o su subunidad beta Ã?-HCG; y c) una molécula de ácido nucleico que puede hibridarse específicamente con el ARN de la alfa-fetoproteína AFP humana.

14. Micromatriz proteínica en fase sólida para la detección y/o clasificación de un cáncer de testículo, particularmente un tumor testicular de células germinales, que comprende: a) un anticuerpo dirigido específicamente contra el péptido pro-EPIL; b) un anticuerpo dirigido específicamente contra el polipéptido HCG o su subunidad Ã?-HCG; y

c) un anticuerpo dirigido específicamente contra el polipéptido AFP humano. fijada sobre un sustrato sólido.

15. Utilización de la expresión del gen del pro-EPIL como biomarcador para el diagnóstico del cáncer de testículo, particularmente un tumor testicular de células germinales.