Moléculas de unión para el factor VIII humano y proteínas similares al factor VIII humano.

Un polipeptido que se une al factor VIII y/o a un polipeptido similar al factor VIII,

caracterizado por que dicho polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos:

Phe-Cys-X18-Val-X19-X20-Phe-X21-His-Cys-X22 (SEQ ID NO: 3), en donde X18 es His o Trp; X19 es His o Phe; X20 es Ala, Asn, His o Pro; X21 es Ala, Asn, Asp, Gln, His, Leu, Ser, o Val; X22 es Ala, Asp, His, Leu, Phe o Ser.

Moleculas de unión para el factor VIII humano y proteinas similares al factor VIII humano.

Campo de la invencian

La presente invención se refiere al campo del aislamiento y purificación de proteinas. Especificamente, la presente

invención se refiere a la identificación, aislamiento y sintesis de moleculas de unión que se unen al factor VIII y/o polipeptidos similares al factor VIII. Tales moleculas de unión son utiles para la detección y purificación del factor VIII y polipeptidos similares al factor VIII a partir de disoluciones que los contienen.

Antecedentes

La hemofilia A clasica es el resultado de una deficiencia ligada al cromosoma X del factor VIII de coagulación del 10 plasma sanguineo, y afecta casi exclusivamente a varones, con una frecuencia de aproximadamente un caso por

10.000. El defecto del cromosoma X es transmitido por portadores femeninos, que en si mismos no tienen la enfermedad. El factor VIII es tambien conocido como factor antihemofilico (AHF, por sus siglas en ingles) , factor hemofilico A, cofactor plaquetario, tromboplastin6geno, trombocitolisina, y globulina antihemofilica (AHG) . La designación "factor VIII:C" se usa para indicar que es el compuesto que afecta a la coagulación. El factor VIII es una

proteina de alto peso molecular de 280 kDa y esta compuesto de dos cadenas polipeptidicas de 200 kDa y 80 kDa respectivamente. Andersson et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. U.S.A., 83:2979-2973 (1986) . Estas cadenas son mantenidas juntas por un puente de un ión metalico.

El principal sintoma de la hemofilia A es el sangrado sin cuajadura o coagulación. Antes del descubrimiento de que la administración de concentrados del factor VIII podria aliviar los sintomas de un individuo diagnosticado con la

enfermedad, la esperanza de vida media de un enfermo era aproximadamente 20 anos.

Hasta estos ultimos anos, la principal fuente de factor VIII para fines terapeuticos era el plasma sanguineo normal; sin embargo, el factor VIII aislado por este metodo, aunque de algun uso, tiene varias desventajas importantes. Por ejemplo, el factor VIII aislado a partir de plasma sanguineo es bastante impuro, teniendo tipicamente una actividad especifica menor que 2 unidades de factor VIII/mg de proteina y un contenido global de factor VIII menor que 1%. 25 Adicionalmente, el procedimiento de purificación es caro, porque el material de partida, es decir, plasma humano, es caro. Tambien se deben tomar muchas precauciones para disminuir el riesgo de transmisión de agentes infecciosos al paciente. Por ejemplo, comunmente se detecta en la sangre donada el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , el virus de la Hepatitis B, el virus de la Hepatitis C y otros agentes causantes de enfermedad. Otra desventaja de usar el factor VIII obtenido por este metodo es que aproximadamente una decima parte de los pacientes con

hemofilia A severa desarrollan anticuerpos contra el factor VIII, haciendo a la enfermedad dificil de tratar.

Los esfuerzos de investigación se han centrado en el desarrollo de metodos para crear y aislar factor VIII biológicamente activo, altamente purificado, en longitud completa y formas derivadas. Las ventajas de una proteina altamente purificada incluyen niveles reducidos de proteinas extranas en la mezcla terapeutica, asi como una disminución de la probabilidad de la presencia de agentes infecciosos. Una forma mas purificada de factor VIII

tambien se puede administrar en dosis mas pequenas, reduciendo posiblemente el riesgo de desarrollar anticuerpos anti-factor VIII, ya que dosis mas bajas serian menos retadoras para el sistema inmunitario.

Se han dado significativos pasos hacia la producción recombinante de factor VIII partiendo del aislamiento de fragmentos de factor VIII biológicamente activos. Vease, Andersson et al., patente de EE.UU. N° 4.749.780; Andersson et al., patente de EE.UU. N° 4.877.614. El gen que codifica la proteina del factor VIII humano de longitud

completa fue aislado aprovechando su homologia de secuencia con el factor VIII porcino. Vease, Toole et al., patente de EE.UU N° 4.757.006. Toole et al. tambien reportan la expresión de proteina humana y porcina que tiene actividad procoagulante de factor VIII:C.

La solicitud de patente internacional WO 92/17192 describe una secuencia polipeptidica basada en un fragmento del factor von Willebrand (vWF) y la patente de EE.UU. N° 5.661.008 describe una secuencia de ADN para un derivado

45 del factor VIII humano.

Sin embargo, aun existen efectos secundarios severos que implican la producción de anticuerpos anti-factor VIII con la administración de la proteina aislada a partir de fuentes tanto humanas como no humanas. Tambien se sabe que los anticuerpos que reaccionan con el factor VIII:C humano reaccionan, hasta cierto punto, con factor VIII:C de otras especies, y el propio factor VIII porcino es antigenico en los seres humanos. Tambien, los no hemofilicos pueden

50 desarrollar o contraer la enfermedad cuando sus sistemas inmunitarios se hacen sensibles al factor VIII:C.

Como una posible solución a este problema, se ha disenado una proteina truncada, de peso molecular mas bajo, que exhibe actividad procoagulante. Vease, Toole, patente de EE.UU. N° 4.868.112. Toole report6 un metodo alternativo de tratamiento con factor VIII porcino de peso molecular mas bajo de aproximadamente 2000 aminoacidos que exhibe una actividad procoagulante similar a la del factor VIII de longitud completa. Evidentemente, 55 la retirada de ciertos aminoacidos y hasta 19 de los 25 posibles sitios de glicosilación redujo la antigenicidad de la proteina, y de este modo la probabilidad de desarrollar anticuerpos anti-factor VIII. Sin embargo, una dificultad con el

desarrollo de factor VIII recombinante es conseguir niveles de producción en rendimientos suficientemente altos.

Recientemente, se han desarrollado moleculas de cDNA de factor VIII delecionadas que codifican derivados de factor VIII recombinante, que fueron proclives a dar rendimientos suficientemente altos de una proteina factor VIII recombinante biológicamente activa para uso en un proceso industrial para una preparación farmaceutica. Vease, Almstedt et al., patente de EE.UU. N° 5.661.008. Almstedt et al. disenaron un factor VIII modificado derivado de un cDNA de factor VIII de longitud completa, que, cuando se expres6 en celulas animales, produjo altos niveles de una proteina similar al factor VIII con actividad de factor VIII. La proteina consisti6 esencialmente en dos cadenas polipeptidicas derivadas del factor VIII humano, teniendo las cadenas pesos moleculares de 90 kDa y 80 kDa, respectivamente.

Segun el procedimiento de Almstedt et al., los cDNAs de factor VIII se ensamblan en unidades de transcripción y se introducen en un sistema huesped adecuado para expresión. Las lineas celulares pueden ser cultivadas a gran escala en cultivo de suspensión o en soporte sólido. La proteina producida en el medio de cultivo es despues concentrada y purificada. La proteina activa final esta constituida por los aminoacidos 1 a 743 y 1638 hasta 2332 del factor VIII humano. Esta secuencia polipeptidica es conocida en el mercado como rFVIII-SQ o REFACTO®. Vease tambien, Lind et al., Euro. J. Biochem., 232:19-27 (1995) . Tambien se pueden construir otras formas de FVIII truncado en las que el dominio B es generalmente delecionado. En tales realizaciones, los aminoacidos de la cadena pesada, que consiste esencialmente en los aminoacidos 1 hasta 740 del Factor VIII humano y que tiene un peso molecular de aproximadamente 90 kD, estan conectados a los aminoacidos de la cadena ligera, que consiste esencialmente en los aminoacidos 1649 a 2332 del Factor VIII humano y que tiene un peso molecular de aproximadamente 80 kD. Las cadenas pesada y ligera pueden estar conectadas por un peptido enlazador de 2 a 15 aminoacidos, por ejemplo un enlazador que comprende residuos de lisina o arginina, o alternativamente, enlazadas por un enlace de ión metalico.

Actualmente, hay una necesidad en este campo de metodos eficaces y rentables para obtener factor VIII activo, purificado, directamente a partir de diversas soluciones tales como sangre o sobrenadantes de cultivos celulares.

La presente invención proporciona nuevos materiales y metodos para identificar, aislar y purificar factor VIII y proteinas similares al factor VIII, incluyendo REFACTO®,... [Seguir leyendo]

1. Un polipeptido que se une al factor VIII y/o a un polipeptido similar al factor VIII, caracterizado por que dicho polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos:

Phe-Cys-X18-Val-X19-X20-Phe-X21-His-Cys-X22 (SEQ ID NO: 3) , en donde X18 es His o Trp; X19 es His o Phe; X20 es Ala, Asn, His o Pro; X21 es Ala, Asn, Asp, Gln, His, Leu, Ser, o Val; X22 es Ala, Asp, His, Leu, Phe o Ser.

2. Un polipeptido que se une al factor VIII y/o a un polipeptido similar al factor VIII, caracterizado por que dicho polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que incluye una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Phe-Asp-His-Cys-His; Phe-Cys-Trp-Val-His-Pro-Phe-Ala-His-Cys-Leu; Phe-Cys-His-Val-Phe-His-Phe-Ser-His-Cys-Asp; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Phe-Asp-His-Cys-His; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Asn-Phe-Ser-His-Cys-Ser; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Asn-His-Cys-Asp; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Asn-His-Cys-Ser; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Gln-His-Cys-Ala; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-His-His-Cys-Phe; Phe-Cys-His-Val-Phe-Asn-Phe-Val-His-Cys-Ser; y Phe-Cys-His-Val-Phe-Pro-Phe-Leu-His-Cys-Asp;

o un polipeptido que se une al factor VIII y/o a un polipeptido similar al factor VIII, caracterizado por que dicho polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que incluye una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:

AEGTGDFCWVFAFDHCHDPGPEGGGS-NHNH2; AEGTGDFCWVFPFQHCADPGPEGGGS-NHNH2; y AEGTGDFCWVFPFHHCFDPGPEGGGS-NHNH2.

3. El polipeptido segun la reivindicación 1, en donde el polipeptido es capaz de unirse al factor VIII humano y/o a un polipeptido similar al factor VIII en una solución que comprende: NH4OAc 100mM, NaCl 0, 8M, Sorbitol 1M, Tween 80 al 0, 02%, EDTA 3mM, CaCl25mM, pH 6, 3, y disociarse de dicho factor VIII humano y/o polipeptido similar al factor VIII en una solución que contiene etilenglicol al 50%.

4. El polipeptido segun la reivindicación 3, que se disocia de dicho factor VIII humano y/o polipeptido similar al factor VIII cuando se pone en contacto con una solución que comprende etilenglicol al 50%, His 20mM, NaCl 0, 25mM, CaCl2 20mM, Tween 80 al 0, 01%, pH 7.

5. El polipeptido segun la reivindicación 3, en donde el polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que incluye una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en: Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Phe-Asp-His-Cys-His; Phe-Cys-Trp-Val-His-Pro-Phe-Ala-His-Cys-Leu; Phe-Cys-His-Val-Phe-His-Phe-Ser-His-Cys-Asp; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Ala-Phe-Asp-His-Cys-His; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Asn-Phe-Ser-His-Cys-Ser; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Asn-His-Cys-Asp;

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Asn-His-Cys-Ser; Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-Gln-His-Cys-Ala;

Phe-Cys-Trp-Val-Phe-Pro-Phe-His-His-Cys-Phe; Phe-Cys-His-Val-Phe-Asn-Phe-Val-His-Cys-Ser; y Phe-Cys-His-Val-Phe-Pro-Phe-Leu-His-Cys-Asp;

o el polipeptido segun la reivindicación 3, en donde la molecula de unión es un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que incluye una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en: AEGTGDFCWVFAFDHCHDPGPEGGGS-NHNH2;

AEGTGDFCWVFPFQHCADPGPEGGGS-NHNH2; y AEGTGDFCWVFPFHHCFDPGPEGGGS-NHNH2.

6. Un metodo para detectar factor VIII humano y/o un polipeptido similar al factor VIII en una solución sospechosa de contenerlo, que comprende:

(a) poner en contacto tal solución con un polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5; y

(b) determinar si se ha producido unión entre dicho polipeptido y dicho factor VIII humano y/o polipeptido similar al factor VIII.

7. Un metodo para purificar factor VIII humano y/o polipeptido similar al factor VIII, que comprende:

(a) inmovilizar un polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un soporte sólido;

(b) poner en contacto una solución que contiene factor VIII humano y/o un polipeptido similar al factor VIII con dicho soporte;

(c) separar la solución de dicho soporte; y

(d) obtener el factor VIII humano y/o polipeptido similar al factor VIII del soporte.

8. Medios de separación, que comprenden:

(a) un material matricial cromatografico, y, inmovilizado en el mismo,

(b) un polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

9. Medios de separación, que comprenden el producto de reacción de:

(a) un material matricial cromatografico reactivo con aminas, y

(b) un polipeptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

10. Los medios de separación de la reivindicación 9, en donde dicho material matricial es una resina cromatografica de metacrilato aldehido-funcional.

11. Los medios de separación de la reivindicación 10, en donde dicha resina es un soporte copolimerico de etilenglicol-metacrilato sustituido con formilo.

12. Un metodo para separar factor VIII o un polipeptido similar al factor VIII de una solución que lo contiene, que comprende:

(a) poner en contacto dicha solución con los medios de separación segun cualquiera de las reivindicaciones 8-11 bajo condiciones de unión,

(b) retirar el material no unido, y

(c) eluir el factor VIII o polipeptido similar al factor VIII unido de dichos medios de separación.