Moléculas de ácidos nucleicos de HDV, sus fragmentos y aplicaciones.

Moleculas de acido nucleico aisladas caracterizadas porque se seleccionan del grupo constituido por:

- el genoma completo de la variante de HDV denominada dFr48, que presenta la secuencia SEQ ID NO: 21, y

- el genoma de un HDV que presenta una divergencia genetica ≤ 15% con la secuencia SEQ ID NO: 21.

Moléculas de ácidos nucleicos de HDV, sus fragmentos y aplicaciones

La presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos procedentes de nuevas cepas o aislamientos del virus de la hepatitis D que constituyen genotipos diferentes a los genotipos conocidos I, II y III, a sus fragmentos, a las 5 proteínas correspondientes, así como a sus aplicaciones como reactivos de diagnóstico.

La presente invención se refiere igualmente a un procedimiento de diagnóstico sensible del virus de la hepatitis D (o virus de la hepatitis delta) , así como a un métodoprocedimiento de seguimiento epidemiológico de las infecciones por HDV.

El virus de la hepatitis D (VHD o HDV, por “hepatitis D virus”) o delta es un virus satélite de la hepatitis B. Este virus

tiene una estructura particular: una estructura quimérica que asocia a componentes específicos del HDV (ARN vírico y proteínas de HD) , una cubierta que comprende las tres glucoproteínas del HBV: grande (preS1-preS2-S) , mediana (preS2-S) y pequeña (S) . El diámetro medio de las partículas de HDV se sitúa entre el de las partículas de HBV maduras (partículas de DANE: 42 nm) y el de las cubiertas vacías de HBV (formas esféricas o filamentosas: 22 nm) , y la densidad de flotación es de 1, 24-1, 25 g/cm3.

En el interior de los viriones, el ARN de HDV es circular y de polaridad negativa. El genoma más pequeño conocido de los virus que infectan a mamíferos, esta hebra monocatenaria circular cerrada tiene un porcentaje elevado de GC (60%) .

El ARN de HDV se replica independientemente de HBV, cuyo papel se limita a proporcionar la cubierta del HDV. Las únicas proteínas encontradas (sHD y LHD) se codifican por el ARN antigenómico que, en la célula infectada, es completo, circular y seudobicatenario, sirve como intermedio de replicación y soporta la edición.

El ARN de HDV pertenece a un tipo de ribozima específico. La reacción de autoescisión requiere ARN y un catión divalente (Mg++) . La escisión crea un extremo 2’, 3’-fosfato cíclico y un extremo 5’ hidroxilo.

Las ribozimas delta (genómica y antigenómica) tienen una configuración secundaria cercana a un pseudonudo. Las secuencias implicadas incluyen principal o exclusivamente secuencias situadas en 3’ del sitio de autoescisión (aproximadamente 84 nucleótidos) .

En el transcurso del ciclo vírico, el ARNm de HDV codifica una proteína que existe en dos formas: una proteína de 194195 aminoácidos (forma “s” de pequeña) de 24 kilodalton (kDa) y una proteína de 214 aminoácidos (forma “L” de grande) de 27 kDa, que existen en proporciones variables. Estas proteínas portan la antigenicidad “delta” y se detectan en el hígado o el suero de pacientes o animales infectados (chimpancés, marmotas) . Estas dos proteínas víricas sHD y LHD se inician en el primer ATG del marco de lectura abierto situado en la posición 1598 (según la numeración de

Wang et al., 1986 o 1987) del ARN antigenómico. En el transcurso de la replicación, aparece una mutación, dependiente de una enzima celular, la adenosina desaminasa dependiente de ARN bicatenarios, en la posición 1012, que transforma el codón de terminación ámbar (UAG) en el codón de triptófano (UGG) , alargando en 3’ el marco de lectura de 10 o 20 codones y confiriendo a las dos formas sHD y LHD propiedades diferentes.

El ARNm termina con una cola de poli (A) , 15 nucleótidos después de la señal de consenso de poliadenilación AAUAAA 35 (posiciones 954-959) .

En el ciclo de replicación, las funciones de las proteínas de 24 y 27 kDa son opuestas: sHD activa la replicación vírica mientras que LHD la reprime y desempeña un papel en el ensamblaje de las partículas víricas. Esas proteínas están fosforiladas en los residuos de serina pero no glucosiladas (Tabla I) . Están constituidas por dominios funcionales comunes y por un dominio específico de la proteína grande LHD.

Tabla I: Resumen y comparación de las funciones de las dos formas p24 y p27 Brevemente, los diferentes dominios de estas dos proteínas son los siguientes:

* dominios comunes

- El dominio de polimerización, que comprende la secuencia entre los residuos aminoacídicos 13 y 48, formado por una disposición de leucina o isoleucina, organizado en hélice a de tipo “cremallera de leucina”, implicado en la polimerización de proteínas, indispensable en (i) la transactivación de la replicación vírica por Ag-sHD, (ii) la inhibición de la replicación por Ag-LHD y (iii) el ensamblado de los complejos sHD-LHD en las cubiertas de HBV.

- La señal de localización nuclear (SLN) , que implica dos secuencias de localización nuclear identificadas en la región 67-88, esenciales para translocar el Ag-sHD sintetizado en el citoplasma, y quizás la ribonucleoproteína después de su entrada en la célula, hacia el núcleo.

- el sitio de fijación a ARN que se basa en dos secuencias ricas en arginina localizadas entre los residuos 97 y 163, que permiten la unión de las proteínas sHD con el ARN genómico o antigenómico. Esta fijación es indispensable para que el Ag-sHD active la replicación.

* dominios específicos

Los 19-20 aminoácidos situados en el extremo COOH de la proteína grande tienen un papel importante en el ciclo del HDV. Efectivamente, estos aminoácidos (aa 195-214) intervienen en el ensamblado de las partículas víricas (Chang et al., 1991) . Esta actividad podría estar ligada en parte a la presencia de una cisteína en la posición 211 (Glenn et al., 1992) conservada para todos los genomas víricos caracterizados hasta ahora. Esta cisteína, situada 4 aminoácidos antes del extremo COOH de la proteína, forma una secuencia “CXXX” y fija un agrupamiento farnesilo (Glenn et al., 1992) , cadena de 15 carbonos derivada del ácido mevalónico, mediante la acción de una farnesiltransferasa. Esta maduración postraduccional orienta las proteínas hacia las membranas celulares.

La proteína pequeña y grande se han diferenciado por otro lado mediante anticuerpos monoclonales (clon 9E4) (Hwang y Lai, 1993a) . Estos anticuerpos solo reconocen a sHD (Lai et al., 1993) . Al estar incluida la secuencia aminoacídica de la proteína pequeña en la grande, estos resultados sugieren una conformación diferente entre sHD y LHD dentro de los 30 aminoácidos carboxiterminales de la proteína pequeña sHD, sugiriendo que el epítopo reconocido en sHD está enmascarado en LHD en condiciones no desnaturalizantes.

El HDV se transmite sobre todo por el contacto con agujas contaminadas y sangre, por tanto a través de los portadores de HDV o HBV.

En América del Norte y Europa Occidental, la hepatitis D se encuentra por tanto, sobre todo, en los usuarios de drogas intravenosas, hemofílicos y aquellos que han recibido transfusiones múltiples.

La epidemiología y los modos de contaminación se superponen en parte. Se estima globalmente en un 5% la proporción de portadores de Ag-HBs infectados por HDV. Sin embargo, se han comprobado disparidades de prevalencia geográfica y epidemiológica.

Existe una alta prevalencia de esta enfermedad en los portadores de la hepatitis B de ciertas regiones del mundo, queincluyen la cuenca amazónica de América del Sur, África central, el sur de Italia y los países de Oriente Medio.

En el portador mediterráneo, muy particularmente en el sur de Italia, Grecia y Oriente Medio, en donde la frecuencia de ser portador crónico del HBV es intermedia (1 a 5%) , la infección por HDV es elevada. En estas regiones, se ha sugerido transmisión intrafamiliar, argumentada por estudios filogenéticos de los virus que infectan a los miembros de una misma familia (Niro et al., 1999) . En el sur de Italia, la prevalencia en el sujeto Ag-HBs positivo va disminuyendo, pasando de un... [Seguir leyendo]

1. Moléculas de ácido nucleico aisladas caracterizadas porque se seleccionan del grupo constituido por:

- el genoma completo de la variante de HDV denominada dFr48, que presenta la secuencia SEQ ID NO: 21, y

- el genoma de un HDV que presenta una divergencia genética : 15% con la secuencia SEQ ID NO: 21.

2. Moléculas de ácido nucleico aisladas, caracterizadas porque comprenden al menos uno de los fragmentos de las secuencias de una variante HDV según la reivindicación 1, seleccionados del grupo constituido por: a) el fragmento R0, que presenta la secuencia SEQ ID NO:50, b) el fragmento R1, que se extiende de las posiciones 307 a 1289 del genoma de HDV, c) el fragmento R2, que se extiende de las posiciones 889 a 328 del genoma de HDV, d) el fragmento R3, que se extiende de las posiciones 1486 a 452 del genoma de HDV, e) el fragmento R’1, que se extiende de las posiciones 305 a 1161 del genoma de HDV, f) el fragmento R’2, que se extiende de las posiciones 984 a 331 del genoma de HDV, g) el fragmento R644, que se extiende de las posiciones 889 a 446 del genoma de HDV, h) el fragmento G910, que se extiende de las posiciones 1206 a 929 del genoma de HDV, i) el fragmento p910, que se extiende de las posiciones 553 a 1550 del genoma de HDV,

j) el ADNc que codifica la proteína sHD, de secuencia SEQ ID NO:24, y k) el ADNc que codifica la proteína LHD, de secuencia SEQ ID NO:22.

3. Método de detección de una variante HDV tal como se define en la reivindicación 1, mediante hibridación y/o amplificación realizada a partir de una muestra biológica, estando caracterizado dicho método porque comprende:

(1) una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus eventualmente presente en la muestra biológica,

(2) la realización de al menos una amplificación génica con la ayuda de un par de cebadores seleccionados del grupo constituido por los cebadores capaces de amplificar una de las regiones siguientes del ARN genómico de HDV: R0, R1, R2, R3, R644, G910, p910, R’1 y R’2 y

(3) el análisis del producto amplificado por comparación con la molécula de secuencia SEQ ID NO:21

4. Método de detección según la reivindicación 3, caracterizado porque la etapa (3) de análisis puede ejecutarse mediante restricción, secuenciación o hibridación.

5. Método según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, caracterizado porque los cebadores específicos para la amplificación de las regiones R0, R1, R2, R3, R644, G910, p910, R’1 y R’2, ejecutada en la etapa (2) , se seleccionan del grupo constituido por:

- los cebadores 900S (SEQ ID NO:33) y 1280AS (SEQ ID NO:34) para la amplificación de R0 (aproximadamente 400 pb) ,

- los cebadores 320S (SEQ ID NO:39) y 1280AS (SEQ ID NO:34) para la amplificación del fragmento R1 (aproximadamente 960 pb) ,

- los cebadores 900S (SEQ ID NO:33) y 320AS (SEQ ID NO:45) para la amplificación de R2 (aproximadamente 1100 pb) , que contiene el gen sHD correspondiente a las posiciones 1598-950,

- los cebadores 1480S (SEQ ID NO:46) y 440AS (SEQ ID NO:47) para la amplificación de R3 (aproximadamente 650 pb) ,

- los cebadores 318S (SEQ ID NO:35) y 1150AS (SEQ ID NO:36) para la amplificación de R’1 (aproximadamente 850 pb) ,

- los cebadores 960S (SEQ ID NO:37) y 345AS (SEQ ID NO:38) para la amplificación de R’2 (aproximadamente 1050 pb) .

6. Método de detección y de genotipado de HDV a partir de una muestra biológica, estando caracterizado dicho método porque comprende:

(a) una etapa de extracción del ácido nucleico que pertenece al genoma del virus HDV,

(b) una etapa de amplificación de la región R0 delimitada por las posiciones 889 a 1289 del genoma de HDV,

(c) un primer tratamiento de las moléculas de ácidos nucleicos amplificadas con las enzimas de restricción SmaI y XhoI, produciendo un primer conjunto de fragmentos de restricción, y

(d) un segundo tratamiento de las moléculas de ácidos nucleicos por la enzima de restricción SacII, produciendo un segundo conjunto de fragmentos de restricción,

(e) el análisis combinado de los dos conjuntos de fragmentos de restricción producidos por RFLP (polimorfismo de longitud de fragmento de restricción) , de manera que se detecte la presencia del HDV dFr48 presente en dicha muestra biológica.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa (b) de amplificación de moléculas de ácido nucleico de dicha muestra por PCR-TI se ejecuta ventajosamente con los cebadores 900S (SEQ ID NO: 33) y 1280AS (SEQ ID NO:34) .

8. Método según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado porque comprende además:

(f) la amplificación de moléculas de ácido nucleico de dicha muestra por PCR-TI con los cebadores 900S (SEQ ID NO:33) y 320AS (SEQ ID NO: 45) de manera que se amplifique la región R2 y

(g) la secuenciación directa de la región R2 amplificada y la comparación con la molécula de ARN de secuencia SEQ ID NO: 21.

9. Vector recombinante, especialmente un plásmido, que comprende un inserto constituido por una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

10. Célula transformada por una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

11. Productos de traducción codificados por la molécula de ARN de secuencia SEQ ID NO: 21, por sus secuencias complementarias codificantes o anticodificantes.

12. Proteínas caracterizadas porque están codificadas por una de las moléculas de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

13. Proteína según la reivindicación 12, caracterizada porque se selecciona del grupo constituido por:

- la proteína LHD de dFr48 que presenta la secuencia SEQ ID NO: 23, y

- la proteína sHD de dFr48 que presenta la secuencia SEQ ID NO: 25.

14. Péptido caracterizado porque está constituido por un fragmento de una proteína según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, seleccionado del grupo constituido por:

- el péptido A constituido por los 19 aminoácidos del extremo carboxiterminal de la secuencia SEQ ID NO: 23,

- el péptido C de secuencia SEQ ID NO: 64.

15. Uso de una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, o de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 para la preparación de un kit de detección y de genotipado de un HDV.