MODIFICACIÓN GENÉTICA DE BACILOS TERMOFÍLICOS HOMOLÁCTICOS.

Modificación genética de bacilos termofílicos homolácticos. La presente invención se refiere a la modificación genética para aplicaciones industriales de especies de Bacillus moderadamente termofílicos que son facultativamente anaeróbicos y homolácticos. El ácido láctico y sus sales, conocidas como lactatos, son productos comercialmente viables, utilizables en diferentes campos, incluyendo la medicina, polímeros biodegradables, y proceso de alimentos. Las especies de Bacillus moderadamente termofílicos que son facultativamente anaeróbicos y homolácticos son organismos ideales para la fabricación industrial de ácido láctico. Son capaces de crecimiento a temperaturas entre 30-65ºC y permiten la fermentación industrial anaeróbica a temperaturas por encima de 50ºC. Esta elevada temperatura tiene varias ventajas cuando se efectúa la fermentación a escala industrial: menos riesgo de infecciones y, por lo tanto, mayor pureza enantiomérica, reacciones más rápidas, etc. La naturaleza homoláctica permite la producción de ácido láctico a partir de fuentes de hidrocarburos (incluyendo azúcares en peso hexosa y pentosa; ver el documento WO 04/063382) sin la formación de más de 15% de productos secundarios, tales como ácido fórmico y ácido acético. La naturaleza anaeróbica facultativa de los Bacillus permite la fermentación en condiciones anaeróbicas o, como mínimo, bajo una presión parcial baja de oxígeno, lo cual es deseable a escala industrial porque permite equipos y procesos relativamente económicos. Además, las exigencias de nutrientes de estas bacterias son menos exigentes que las bacterias de ácido láctico, tales como las de las especies LactoBacillus, lo que permite también un proceso industrial relativamente económico. Una desventaja de los Bacillus moderadamente termofílicos conocidos que son facultativamente anaeróbicos y homolácticos, es el hecho de que no producen R-lactato o virtualmente no lo hacen. Dado que la aplicación satisfactoria de polímeros biodegradables de ácido láctico dependerá en la disponibilidad de ácido S-láctico y ácido R-láctico poco costosos, se requiere una producción efectiva en cuando a costes de ambos enantiómeros. Las bacterias actualmente conocidas para la producción de R-lactatos son, o bien mesofílicas (por ejemplo, Bacillus laevolacticus) o tienen exigentes requerimientos de nutrientes (por ejemplo, LactoBacillus delbrueckii), lo que hace la fabricación de R-lactato mucho más cara que la del S-lactato. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención consiste en conseguir una cepa de Bacillus moderadamente termofílica que es facultativamente anaeróbica y que produce ácido R-láctico por fermentación homoláctica. Otro objetivo de la invención es conseguir un método para producir bacilos moderadamente termofílicos mediante ingeniería genética, que son facultativamente anaeróbicos y homolácticos. El género Bacillus comprende más de 200 especies distintas (Ver Sneath, P.H.A., 1986: Endospore-forming Grampositive rods and cocci. en el manual de Bergeys de bacteriología sistemática Vol 2. Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Sharpe, M.E., Holt, J.G. (eds) Williams & Wilkins, Baltimore). Solamente, una pequeña fracción de éstas son conocidas como accesibles genéticamente. Por ejemplo, la transformación de protoplastos funciona para una serie de especies distintas de Bacillus, pero la transformación de células competentes ha sido demostrada solamente que funciona satisfactoriamente para células de Bacillus subtilis 168, estrictamente aeróbicas y mesofílicas. Las cepas industriales son frecuentemente más resistentes a la modificación genética, tal como es sabido por Bacillus licheniformis. Esta especie de Bacillus moderadamente termofílicos, facultativamente anaeróbicos, se utiliza para la producción industrial de enzimas. No obstante, dado su naturaleza heteroláctica, no se puede utilizar para la producción de ácido láctico (Ver Bulthuis, B. A., C. Rommens, G.M. Koningstein, A. H. Stouthamer, H. W. van Verseveld, 1991: Formation of fermentation products and extracellular protease during anaerobic growth of Bacillus licheniformis in chemostat and batch-culture, Antonie van Leeuwenhoek 60:355-371). En general, los procesos de transformación de alta frecuencia no son disponibles para cepas industriales (Ver Outtrup, H., y S. T. Jørgensen, 2002: The importance of Bacillus species in the production of industrial enzymes in Applications and systematics of Bacillus and relatives. R. Berkeley, M. Heyndrickx, N. Logan, y P. of Vos (eds.), pp. 206-218, Blackwell Publishing, Malden, USA). Estas cepas pueden ser modificadas por transformación de protoplastos, tal como se da a conocer en el documento US 6.083.718. Hasta el momento, no se han descrito métodos que demuestren ingeniería genética de especies de Bacillus moderadamente termofílicos que son facultativamente anaeróbicos y homolácticos. Si bien se ha publicado un informe que reivindica la transferencia de plásmido de B. subtilis a Bacillus coagulans por fusión de protoplástos (Ver Ball, A.S., y C. Edwards, 1989: Properties of protoplasts from the thermophile Bacillus coagulans and their significance for genetic studies. Lett. Appl. Microbiol. 9:141-144), no proporciona pruebas de que B. coagulans albergue ciertamente el plásmido. Dicha reivindicación se basa solamente en la observación del crecimiento de colonias resistentes a antibióticos, que podrían consistir igualmente en mutantes espontáneos resistentes a los antibióticos. Los inventores han observado dichos mutantes espontáneos resistentes a los antibióticos de B. coagulans frecuentemente para varios tipos de antibióticos. En otra publicación: Transformation of Bacillus spp.: An Examination of the transformation of Bacillus protoplasts by plasmids pUB110 and pHV33, Current Microbiology, Vol 13 (1986), pp 191-195, se ha descrito la transformación de protoplástos en diferentes bacilos. No obstante, la transformación en B. coagulans se indicó como no satisfactoria. 2   La electroporación es utilizada ampliamente para bacterias, pero requiere la optimización específica para la especie (o incluso específica para la cepa) del medio de crecimiento y del tampón de electroporación. La electroporación satisfactoria de especies de Bacillus requiere frecuentemente metilación in vivo o in vitro de ADN plásmido para impedir su restricción después de la transformación. El documento WO 02/29030 da a conocer la introducción in vivo de plásmido metilado en células de la cepa TN de Bacillus termofílico por electroporación. El plásmido utilizado se basa en el plásmido termosensible pUB110. No obstante, los inventores han descubierto que este plásmido no proporcionó células transformadas cuando se utilizó para transformar especies de Bacillus moderadamente termofílicas que son facultativamente anaeróbicas y homolácticas. Los inventores han descubierto que es posible la modificación genética de especies de Bacillus moderadamente termofílicas que son facultativamente anaeróbicas y homolácticas por ingeniería genética. De este modo, la presente invención demuestra por primera vez que la ingeniería genética de especie Bacillus homoláctica facultativamente anaeróbica, moderadamente termofílica por transformación. Además de la ingeniería genética de dichos Bacillus moderadamente termofílicos que son facultativamente anaeróbicos y homolácticos para la producción de ácido R-láctico, los bacilos pueden ser sometidos también a ingeniería genética para la producción de compuestos industriales, incluyendo otros ácidos orgánicos a parte del ácido láctico, alcohol, enzimas, aminoácidos y vitaminas. De acuerdo con la invención, es importante que la especie Bacillus moderadamente termofílica sea homoláctica, porque esto asegura que la nueva funcionalidad introducida tendrá como resultado una producción con alto rendimiento con una pequeña cantidad de subproductos. Además, la utilización de la especie Bacillus homoláctica posibilita que solamente se tienen que aplicar unas pocas modificaciones a efectos de obtener un microorganismo industrialmente aplicable. La especie Bacillus moderadamente termofílica, se definen como bacterias capaces de crecer a temperaturas comprendidas entre 30-65ºC. Son ejemplos de especies moderadamente termofílicas facultativamente anaeróbicas homolácticas, Bacillus coagulans y Bacillus smithii. Los bacilos homolácticos pueden producir de manera natural Slactato por fermentación homoláctica. Cuáles son las cepas específicas que pueden producir ácido láctico por fermentación homoláctica se puede determinar fácilmente por los técnicos en la materia. La presente invención comprende también cepas derivadas de especie Bacillus, facultativamente anaeróbica, moderadamente termofílica, en la que el fenotipo homoláctico... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la modificación de especies de Bacillus moderadamente termofílicos que son facultativamente anaeróbicos y homolácticos por ingeniería genética, comprendiendo: introducir un ADN clonado en un sistema de plásmido termosensible, conteniendo un replicón pSH71 o un homólogo del mismo, cuyo homólogo comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene una funcionalidad de replicación termosensible (proteína RepA) que tiene una secuencia de aminoácido que es, como mínimo, 80% idéntica a la SEQ ID NO:1, en células de una especie Bacillus moderadamente termofílica, que es facultativamente anaeróbica y homoláctica; cultivar las células en un medio selectivo a una temperatura permisiva para replicación de plásmido para seleccionar células transformadas capaces de crecimiento en dicho medio selectivo a dicha temperatura permisiva; cultivar dichas células transformadas en un medio selectivo a una temperatura no permisiva para la replicación de plásmido seleccionar células transformadas capaces de crecimiento en dicho medio selectivo a dicha temperatura no permisiva. 2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la especie Bacillus son Bacillus smithii y/o Bacillus coagulans. 3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, en el que la especie Bacillus es deficiente en cuanto a esporulación. 4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la especie Bacillus es un derivado moderadamente termofílico y facultativamente anaeróbico de una especie parental de Bacillus moderadamente termofílica, que es facultativamente anaeróbica y homoláctica. 5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ADN proporciona una funcionalidad deseada. 6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el cultivo a la temperatura no permisiva para replicación de plásmido, permite la introducción del ADN en el cromosoma de Bacillus, preferentemente, por recombinación homóloga. 7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la funcionalidad no deseada es eliminada del cromosoma de Bacillus, por recombinación homóloga. 8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se introduce una funcionalidad deseada en el cromosoma de Bacillus y, simultáneamente, se elimina una funcionalidad no deseada del cromosoma de Bacillus, por recombinación homóloga. 9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que la especie Bacillus es modificada sustituyendo el gen que codifica S lactato dehidrogensasa por un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácido, de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácido, sustancialmente homóloga de la misma, que tiene actividad de R lactato dehidrogenasa fusionada a un promotor funcional en una especia Bacillus. 10. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que el promotor es del endógeno S lactato dehidrogenasa es eliminado. 11. Cepa de Bacillus, moderadamente termofílica de ingeniería genética, que es facultativamente anaeróbica y homoláctica, en la que el gen IDIL que codifica para S lactato dehdrogenasa, es sustituido por un gen que codifica para 2 hidroxi-ácido dehidrogenasa, dependiente de NADH que tiene actividad de R lactato dehidrogenasa, en el que dicha cepa de Bacillus se puede obtener por un método, según la reivindicación 9 ó 10. 12. Procedimiento para la preparación de ácido R láctico y/o R lactato, en el que se utiliza la especie Bacillus moderadamente termofílica genéticamente modificada, que es facultativamente anaeróbica, de la reivindicación 11. 21   22   23   24     26   27   28