MÉTODO PARA PRODUCIR UN PÉPTIDO CON UN PI SUPERIOR A 8 O INFERIOR A 5.

Método para producir un péptido con un pI superior a 8 o inferior a 5 Campo de la invención Esta invención se refiere a métodos y a reactivos útiles en la producción de péptidos. En particular, la invención se refiere a la producción de péptidos que tienen pIs por debajo de aproximadamente 5 o por encima de aproximadamente 8. Una realización preferida de la invención se refiere a la producción de péptido natriurético de tipo b. Antecedentes de la invención La presente invención se dirige a métodos eficaces para expresar y recuperar un péptido, particularmente cuando el péptido que se desea producir tiene un alto pI o un bajo pI, lo que hace deseable emplear cromatografía de intercambio iónico (IEC) como etapa en la purificación del péptido. Se pondrán ejemplos de la invención con respecto a péptido natriurético de tipo b, que tiene un pI relativamente alto. No obstante, los expertos en la técnica apreciarán que los métodos y los reactivos descritos aquí tendrán aplicabilidad para la producción de otros péptidos que tengan pI alto o bajo. Es bien sabido en la técnica que la producción de péptidos de menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud por expresión de ADN que codifica péptido en una célula hospedante recombinante tal como E. coli está plagada comúnmente por el problema de la degradación enzimática del péptido expresado dentro de la célula hospedante, produciendo una pérdida parcial o completa del péptido. El medio empleado más comúnmente para superar este problema es insolubilzar el péptido dentro de la célula hospedante. Esto puede efectuarse expresando el péptido como una proteína de fusión en la que el péptido está enlazado a un asociado de fusión. Normalmente, el asociado de fusión estará fusionado al término N del péptido. La proteína de fusión forma cuerpos de inclusión dentro de la célula, dentro de la cual se protege al péptido de degradación por enzimas proteolíticas. Una vez recuperados los cuerpos de inclusión de la célula hospedante, debe separarse el péptido de la secuencia líder, purificarse y recuperarse en forma activa. La separación de la secuencia líder puede conseguirse poniendo una secuencia de aminoácidos en la unión de la líder y el péptido, que son reconocidos y divididos específicamente en condiciones apropiadas, por ejemplo, división por ácido o división enzimática. La división enzimática no es práctica frecuentemente para producción a escala comercial debido al alto coste de la enzima y duración útil limitada, incluso cuando se emplea en una columna inmovilizada. La división por ácido puede conseguirse poniendo un dipéptido específico en la unión de la secuencia líder y el péptido, en la que el primer aminoácido del dipéptido es ácido aspártico. La selección del segundo aminoácido determinará la velocidad a la que se divide el enlace dipéptido en condiciones ácidas. Por supuesto, si el péptido deseado contiene algunas secuencias de dipéptido internas que son divisibles por ácido, el lugar de división en la unión de la líder y el péptido debe experimentar división por ácido a una velocidad sustancialmente mayor que la división interna con el fin de evitar pérdidas inaceptables de rendimiento. Las velocidades de reacción relativas de dipéptidos divisibles por ácido son como sigue: Dipéptido Velocidad de reac. relat. Asp-Pro* 10x Asp-X X = Gly*, Ser*, Leu*, Ile, Val 1x Asp-Lys* 0,5x Asp-Arg** 0,2x * F. Marcus, Int. J. Peptide and Protein Res. (1985) 25: 542.546 ** Observaciones de los inventores Antes de la división enzimática o por ácido, la proteína de fusión de los cuerpos de inclusión se solubiliza normalmente por tratamiento con un agente caotrópico que causa el despliegue de la estructura de proteína. La proteína de fusión solubilizada se divide después, el péptido deseado se aísla y purifica y el péptido se somete a condiciones que lo hacen replegarse en una conformación activa biológicamente, tal como por separación del caotropo y oxidación, si es necesario para ocasionar la formación de enlaces disulfuro internos. El péptido conocido como péptido natriurético de tipo b o BNP tiene lugar en seres humanos como un péptido de 32 aminoácidos que se produce in vivo por la división de una proteína precursora de 134 aminoácidos. Se ha aislado la secuencia de ADN que codifica el precursor natriurético de tipo b (Patente de los EE.UU. Nº 5.114.923). Se ha mostrado en pruebas clínicas humanas que el péptido natriurético de tipo b mejora la función del corazón sin estimulación cardíaca directa (que puede causar efectos secundarios dañinos tales como arritmias) y a niveles disminuidos de 2   neurohormonas asociadas con mortalidad acrecentada y aceleración de la progresión de fallo cardíaco. Por consiguiente, es útil en el tratamiento de pacientes con fallo cardíaco congestivo. Aunque el péptido natriurético de tipo b ofrece ciertas ventajas clínicas sobre otros fármacos usados para tratar pacientes con fallo cardíaco congestivo, el coste relativamente alto de producción de fármacos péptidos en comparación con fármacos no péptidos podría presentar un impedimento para su aceptación en la práctica clínica. En consecuencia, hay necesidad de proporcionar un medio altamente eficaz para producir péptido natriurético de tipo b con el fin de minimizar su coste. La producción recombinante del péptido en forma de cuerpos de inclusión presenta varios problemas. El uso de división enzimática de una proteína de fusión para producir péptido natriurético de tipo b es indeseable por el alto coste de las enzimas que se requerirían. Si se desea tomar ventaja del pI relativamente alto de péptido natriurético de tipo b ( 10) usando cromatografía de intercambio iónico como etapa de purificación, ha de evitarse el uso de un caotropo iónico tal como hidrocloruro de guanidina, porque el caotropo iónico interferirá con la cromatografía de intercambio iónico. Por otra parte, la urea, el caotropo no iónico usado más comúnmente, es problemática si se ha de emplear división por ácido de la proteína de fusión. Bajo condiciones ácidas a alta temperatura, la presencia de urea causa la degradación del péptido. El documento W092/02550 describe el aumento artificial del pI de una proteína de fusión hasta por encima de 8,0 para facilitar la purificación desde los cuerpos de inclusión usando urea 6M, seguido de cromatografía de intercambio iónico. Tras la división de los asociados de fusión estos se separan en una etapa adicional de purificación por intercambio iónico. En el documento US 5.670.340 se hicieron proteínas de fusión comprenden una proteína de interés con un pI muy bajo, mediante lo cual se observó que un pI de la proteína de fusión de entre 4,9-6,9 era óptimo para la expresión en la forma de cuerpos de inclusión. Sumario de la invención En la presente invención, la división por ácido de la proteína de fusión se realiza en ausencia de caotropos, produciendo péptido natriurético de tipo b soluble. El péptido soluble puede separarse del asociado de fusión y otros contaminantes, que permanecen insolubles, usando cualquier método conveniente conocido para separar proteínas solubles de proteínas insolubles, por ejemplo, por ultrafiltración, diafiltración o centrifugación. Puesto que la ultrafiltración y la centrifugación son etapas subóptimas desde un punto de vista comercial, una realización preferida de la invención emplea solubilización de los materiales insolubles, tras la división, por tratamiento con un caotropo no iónico tal como urea, y aislamiento de péptido natriurético de tipo b por cromatografía de intercambio iónico. La presente invención proporciona un método eficaz para producir un péptido que tiene un pI por encima de aproximadamente 8 o por debajo de aproximadamente 5. Una realización preferida del método de la invención comprende las etapas de: (a) expresar dicho péptido en una célula hospedante recombinante como una proteína de fusión, en la que el péptido deseado está fusionado en su término N a un asociado de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un residuo Asp en su término C, en la que (i) el residuo Asp C-terminal del asociado de fusión y el residuo N-terminal del péptido forman un enlace que es divisible en condiciones ácidas, (ii) el péptido tiene una carga neta lo suficientemente diferente de la del asociado de fusión y cualesquiera fragmentos indeseados producidos por división con ácido de la proteína de fusión para que el péptido sea capaz de ser separado del asociado de fusión y cualesquiera fragmentos de división por ácido indeseados de la proteína de fusión por cromatografía de intercambio iónico y (iii) la proteína de fusión forma cuerpos de inclusión dentro de la célula... [Seguir leyendo]

1. Un vector para la expresión en una célula hospedante de una proteína de fusión que es divisible en condiciones ácidas para producir un péptido deseado que tiene un pI por encima de 8 o por debajo de 5, comprendiendo dicho vector: (a) una secuencia de ADN que codifica un asociado de proteína de fusión con una carga neta tal que el pI de la proteína de fusión está entre 6,0 y 8,0; (b) un codón que codifica ácido aspártico, que está enlazado al extremo 3 de la secuencia de ADN que codifica el asociado de la proteína de fusión de (a); (c) una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado que tiene un pI superior a 8 o inferior a 5 y que tiene un residuo de prolina, glicina, serina, leucina, alanina, isoleucina o valina en su término N, estando enlazada dicha secuencia de ADN en su extremo 5 al extremo 3 del codón que codifica ácido aspártico de la parte (b); y (d) una secuencia reguladora capaz de dirigir la expresión de la proteína de fusión en la célula hospedante que está enlazada operativamente a la secuencia de ADN que codifica el asociado de la proteína de fusión, donde la diferencia de carga neta entre el péptido deseado y el asociado de fusión y cualesquiera otros fragmentos no deseados producidos por la división ácida del asociado de fusión es al menos ± 2, para permitir que el péptido deseado se aísle desde la mezcla de división mediante cromatografía de intercambio iónico. 2. Un vector según la reivindicación 1, en el que el asociado de la proteína de fusión codificado es una porción Nterminal modificada de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: 3. Un vector según la reivindicación 1, en el que el asociado de la proteína de fusión codificado tiene una carga neta tal que la proteína de fusión tiene un pI de 6,5 a 7,5. 4. Un vector según la reivindicación 1, en el que el péptido deseado es péptido natriurético de tipo b. 5. Un vector según la reivindicación 1, en el que la secuencia reguladora incluye un promotor phoA. 6. Un vector según la reivindicación 1, en el que el asociado de la proteína de fusión codificado es una porción Nterminal modificada de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) que contiene al menos 50 residuos de aminoácidos que corresponden a los 50 residuos de aminoácidos N-terminal de la siguiente secuencia de CAT de tipo silvestre: 7. Una célula hospedante que contiene el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 14     16   17   18   19