Ensayo y reactivos para cuantificar BNPh.

Un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en:

(a) la secuencia aminoacídica VQGSGCFGR del péptido natriurético cerebral humano (BNPh); o

(b) la secuencia aminoacídica SPKMVQGSGC de BNPh; o

(c) la secuencia aminoacídica MDRISSSSGLG de BNPh;

o un fragmento del mismo que conserve la reactividad monoespecífica de dicho anticuerpo.

Ensayo y reactivos para cuantificar BNPh

Antecedentes de la invención I. Campo de la Invención Esta invención está relacionada con el campo de los inmunoensayos, más particularmente, con reactivos y métodos útiles para la cuantificación rápida y sensible de la hormona peptídica BNPh en un fluido biológico, como el plasma o el suero.

II. Descripción de los antecedentes en este campo El BNP es una hormona peptídica derivada cardiaca que circula en la sangre y ejerce potentes acciones cardiovasculares y renales. El BNP es similar estructuralmente a otros dos péptidos cardiacos, el péptido natriurético atrial (ANP) y el péptido natriurético tipo C (CNP) . El BNP porcino fue aislado de cerebro porcino (Sudoh, et al., Nature 332:78-81, 1988) y, de ahí, le fue dado el nombre de “péptido natriurético cerebral”. En el hombre el ventrículo cardiaco es el lugar principal de síntesis del BNP. La secuencia del BNP humano (BNPh) fue determinada originariamente por medio del aislamiento y caracterización de clones de ADN procedentes de librerías genómicas humanas (Patente americana Nº 5.114.923) . El BNPh es sintetizado in vivo como un precursor de 108 aminoácidos que es clivado enzimáticamente para proporcionar el péptido BNPh maduro. El BNPh maduro consiste en un péptido de 32 aminoácidos conteniendo una estructura de anillo de 17 aminoácidos formada por dos enlaces disulfuro (ver Fig. 1) .

Ha sido reportada una elevada expresión de ARNm del BNPh ventricular en pacientes con fallo cardiaco congestivo cuando es comparada con los controles normales. Consecuentes con el aumento en masa ventricular y expresión de ARNm del BNP, los niveles de BNPh son elevados en pacientes con fallo cardiaco congestivo y parece que tienen correlación con la severidad de la enfermedad. Se cree también que el BNPh plasmático proporciona un valioso marcador predictivo de la enfermedad cardiaca. Ha sido reportado un elevado BNPh plasmático en la enfermedad cardiaca, después de infarto de miocardio agudo y durante disfunción ventricular asintomática o subclínica (Mukoyama et al., J. Clin. Invest., 87:1402-1412, 1991) (Motwani et al., Lancet, 341: 1109-1113, 1993) (Yoshibayashi et al., New Eng. J. Med., 327 :434, 1992) . Informes procedentes de dos importantes estudios terapéuticos, el estudio SAVE (New Eng. J. Med., 327:669-677, 1992) y el estudio SOLVD (New Eng. J. Med., 327:685-691, 1992) sugirieron que el diagnóstico y tratamiento apropiado de pacientes con disfunción ventricular izquierda asintomática podría reducir de forma significativa la incidencia de sucesos cardiovasculares fatales o no fatales y las hospitalizaciones relacionadas con los mismos.

Para su utilización en un escenario de laboratorio clínico, sería deseable en alto grado el proporcionar un ensayo diagnóstico para BNPh que fuera lo suficientemente sensible como para medir títulos clínicamente relevantes de BNPh, lo suficientemente sencillo como para que fuera automatizado, que requiriera una mínima cantidad de tiempo para llevarse a cabo y que, preferiblemente, no requiriera la utilización de reactivos con un tiempo limitado de durabilidad. Los niveles normales de BNPh en plasma son bastante bajos, del orden de 1 a 20 pg/mL. Usualmente son utilizados radioinmunoensayos para medir títulos en este rango, aunque la utilización de reactivos radioactivos requiere de un manejo especial, añade fases al ensayo e implica la utilización de material que posee un tiempo limitado de durabilidad. Se encuentra disponible en el mercado un radioinmunoensayo para la medición del BNPh. Sin embargo, además de requerir la utilización de reactivos radioactivos, es complejo e incómodo, requiriendo una fase de extracción, precipitación y varias fases de centrifugado, y lleva varios días para su realización. La Solicitud de Patente Europea Nº 0 542 255 describe un radioinmunoensayo para BNPh.

Resumen de la invención La presente invención proporciona reactivos y métodos para la cuantificación rápida y directa de los niveles de BNPh en fluidos biológicos. Los reactivos y métodos aquí proporcionados permiten la detección de títulos de BNPh a niveles clínicamente relevantes sin la utilización de marcaje radioactivo (aunque puede ser utilizado el marcaje radioactivo, si así se desea) . Además, proporcionan la cuantificación directa de BNPh en el plasma sin que sean necesarias incómodas fases de extracción. Los reactivos y métodos aquí proporcionados se prestan fácilmente a los sistemas automatizados utilizados para realizar pruebas sanguíneas a gran escala en laboratorios clínicos comerciales.

En una realización de la invención son proporcionados anticuerpos monoespecíficos de epítopes peptídicos seleccionados dentro de la molécula de BNPh. Preferiblemente, estos anticuerpos monoespecíficos son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoespecíficos de la invención son seleccionados de entre el grupo consistente en:

(a) un anticuerpo que es monoespecífico de un epítope peptídico que consiste en los aminoácidos 5-13 de BNPh;

(b) un anticuerpo, que es monoespecífico de un epítope peptídico que consiste en los aminoácidos 1-10 de

BNPh; y

(c) un anticuerpo que es monoespecífico de un epítope peptídico que consiste en los aminoácidos 15-25 de BNPh o fragmentos del mismo que retienen la reactividad monoespecífica de dicho anticuerpo.

Un anticuerpo preferido de la invención es un anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al epítope peptídico que consiste en los aminoácidos 5-13 de BNPh.

En otra realización de la invención es proporcionado un método para cuantificar la cantidad de BNPh en un fluido biológico utilizando los reactivos de la invención en un inmunoensayo de tipo sándwich. El inmunoensayo puede emplear cualquiera de las numerosas técnicas de marcaje para marcar y cuantificar complejos inmunes, siendo preferido el marcaje enzimático. Este método de la invención comprende las etapas de:

(a) puesta en contacto de una muestra del fluido biológico con un primer anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste en:

(i) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en los aminoácidos 5-13 de BNPh;

(ii) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en los aminoácidos 1-10 de BNPh;

(iii) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en los aminoácidos 15-25 de BNPh; y fragmentos de (i) - (iii) que retienen dicha reactividad monoespecífica. y un segundo anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste en:

(i) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en los aminoácidos 5-13 de BNPh;

(ii) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en los aminoácidos 1-10 de BNPh;

(iii) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en los aminoácidos 1525 de BNPh;

(iv) un anticuerpo policlonal de elevada afinidad a BNPh; y fragmentos de (i) - (iv) que retienen dicha reactividad monoespecífica, en condiciones que permitan la formación de un complejo de primer anticuerpo-BNPh-segundo anticuerpo;

(b) unir una marcador cuantificable a dicho segundo anticuerpo antes de, simultáneamente con o después de la formación del complejo primer anticuerpo-BNPh-segundo anticuerpo; y

(c) la determinación de la cantidad de BNPh en la muestra por medio de la cuantificación del marcador en el complejo primer anticuerpo-BNPh-segundo anticuerpo.

En otras realizaciones de la invención son proporcionados métodos para cuantificar la cantidad de BNPh en un fluido biológico utilizando los reactivos de la invención en inmunoensayos de tipo competitivo. Uno de estos ensayos comprende las fases de:

(a) puesta en contacto de una muestra del fluido biológico con:

(i) un anticuerpo que es monoespecífico de un epítope peptídico que consiste en los aminoácidos 5-13 del BNPh o un fragmento del mismo que retiene la reactividad monoespecífica de dicho anticuerpo; y

(ii) BNPh, o un fragmento del mismo, comprendiendo los aminoácidos 5-13 del BNPh, teniendo unido al mismo un marcador cuantificable, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo anticuerpo-BNPh; y

(b) determinación de la cantidad de BNPh en la muestra por medio de la cuantificación del marcador en el complejo anticuerpo-BNPh.

Otra realización del ensayo de la invención en un formato de tipo competitivo comprende las fases de:

(a) puesta en contacto de una muestra del fluido biológico con:

(i) un anticuerpo que es monoespecífico de un epítope... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en:

(a) la secuencia aminoacídica VQGSGCFGR del péptido natriurético cerebral humano (BNPh) ; o

(b) la secuencia aminoacídica SPKMVQGSGC de BNPh; o

(c) la secuencia aminoacídica MDRISSSSGLG de BNPh;

o un fragmento del mismo que conserve la reactividad monoespecífica de dicho anticuerpo.

2. Un anticuerpo de la reivindicación 1 que es un anticuerpo monoclonal.

3. Un método para cuantificar la cantidad de péptido natriurético cerebral humano (BNPh) en un fluido biológico que comprende:

(a) poner en contacto una muestra del fluido biológico con un primer anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en la secuencia aminoacídica VQGSGCFGR de BNPh;

(ii) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en la secuencia aminoacídica SPKMVQGSGC de BNPh; y

(iii) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en la secuencia aminoacídica MDRISSSSGLG de BNPh; y fragmentos del mismo que conserven dicha reactividad monoespecífica, y un segundo anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en la secuencia aminoacídica VQGSGCFGR de BNPh;

(ii) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en la secuencia aminoacídica SPKMVQGSGC de BNPh;

(iii) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en la secuencia aminoacídica MDRISSSSGLG de BNPh;

(iv) un anticuerpo policlonal de elevada afinidad con BNPh; y fragmentos del mismo que conserven dicha reactividad monoespecífica, en condiciones que permitan la formación de un complejo primer anticuerpo-BNPh-segundo anticuerpo;

(b) unir un marcador cuantificable con dicho segundo anticuerpo, antes de, simultáneamente con o después de la formación del complejo primer anticuerpo-BNPh-segundo anticuerpo; y

(c) determinar la cantidad de BNPh en la muestra cuantificando el marcador en el complejo primer anticuerpoBNPh-segundo anticuerpo.

4. Un método para cuantificar la cantidad de BNPh en un fluido biológico que comprende:

(a) poner en contacto una muestra del fluido biológico con:

(ia) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en la secuencia aminoacídica VQGSGCFGR de BNPh o un fragmento del mismo que conserve la reactividad monoespecífica de dicho anticuerpo; y (iia) BNPh o un fragmento del mismo que comprende la secuencia aminoacídica VQGSGCFGR de BNPh, que tiene unido a este un marcador cuantificable, en condiciones que permitan la formación de un complejo anticuerpo-BNPh; o (ib) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en la secuencia aminoacídica SPKMVQGSGC de BNPh o un fragmento del mismo que conserve la reactividad monoespecífica de dicho anticuerpo; y (iib) BNPh o un fragmento del mismo que comprende la secuencia aminoacídica SPKMVQGSGC de BNPh, que tiene unido a este un marcador cuantificable, en condiciones que permitan la formación de un complejo anticuerpo-BNPh; o (ic) un anticuerpo que es monoespecífico para un epítope peptídico que consiste en la secuencia aminoacídica MDRISSSSGLG de BNPh o un fragmento del mismo que conserve la reactividad monoespecífica de dicho anticuerpo; y (iic) BNPh o un fragmento del mismo que comprende la secuencia aminoacídica MDRISSSSGLG de BNPh, que tiene unido a este un marcador cuantificable, en condiciones que permitan la formación de un complejo anticuerpo-BNPh; y

(b) determinar la cantidad de BNPh en la muestra cuantificando el marcador en el complejo anticuerpo-BNPh.