Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido,

que comprende:

proporcionar un anticuerpo inicial que presenta una especificidad para una diana;

determinar la secuencia de una región variable del anticuerpo inicial; y

(i) seleccionar un primer componente de la región variable, comprendiendo dicho primer componente una región de marco seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3;

comparar la secuencia del primer componente de la región variable con secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de una especie diana;

seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el primer componente;

determinar de qué familia génica de línea germinal se ha derivado la secuencia;

(ii) seleccionar un segundo componente de la región variable que es diferente del primer componente, comprendiendo el segundo componente una región de marco seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3;

comparar la secuencia del segundo componente con secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de la especie diana;

seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el segundo componente y que corresponde a la misma familia génica de línea germinal que la primera secuencia seleccionada de la base de datos de la etapa (i);

(iii) seleccionar un tercer componente de la región variable que es diferente de los primer y segundo componentes, comprendiendo el tercer componente una región de marco seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3;

comparar la secuencia del tercer componente con las secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de la especie diana;

seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el tercer componente y que corresponde a la misma familia génica de línea germinal que la primera secuencia seleccionada de la base de datos de la etapa (i); y (iv) ligar operativamente las secuencias de marco seleccionadas con una o más CDR del anticuerpo inicial con el fin de producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido.

Método para producir anticuerpos híbridos.

Campo técnico

La presente descripción se refiere a anticuerpos híbridos y a fragmentos de anticuerpos híbridos derivados de una especie que se unen preferentemente a un objeto diana y que presentan una inmunogenicidad reducida en una especie diferente.

Antecedentes de la técnica relacionada Los anticuerpos son proteínas producidas por los linfocitos, conocidos como células B en los vertebrados, en respuesta a la estimulación por parte de antígenos. La unidad estructural básica de una molécula de anticuerpo también conocido como inmunoglobulina (Ig) ) está constituida por cuatro cadenas polipeptídicas que se reúnen en forma de una letra "Y" mayúscula. Dos de las cuatro cadenas son cadenas ligeras (L) idénticas y dos son cadenas pesadas (H) idénticas. Existen cinco tipos (isotipos) diferentes de cadena pesada, lo que divide a los anticuerpos en cinco clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Además, existen dos isotipos diferentes de cadena ligera denominados K y A. Cada clase de cadena pesada puede combinarse con cualquiera de las cadenas ligeras. Las cadenas pesadas y ligeras contienen, cada una, una región variable (VH y VL, respectivamente) , que participa en la unión del antígeno, y una región constante (C) . El sitio de unión a antígeno está compuesto de seis regiones hipervariables (también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) ) . Tres CDR de la cadena pesada y tres CDR de la cadena ligera se encuentran situadas, respectivamente, entre cuatro hojas º antiparalelas relativamente conservadas que se denominan regiones de marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) , en cada cadena. Por convención, los sistemas de numeración se han utilizado para referirse a la localización de las partes que componen las cadenas VH y VL. La definición de Kabat se basa en la variabilidad de las secuencias y la definición de Chothia se basa en la localización de las regiones bucle estructurales.

Para cada tipo de cadena de Ig sintetizada por las células B, existe un grupo separado de segmentos génicos, conocido como genes de línea germinal, a partir de los que se sintetiza una cadena polipeptídica individual. Cada grupo se encuentra situado en un cromosoma diferente y típicamente contiene un número relativamente grande de segmentos génicos codificantes de la región V y un número más pequeño de segmentos génicos codificantes de la región C. Cada región V de cadena ligera se encuentra codificada por una secuencia de ácidos nucleicos formado por dos tipos de segmentos génicos de línea germinal, es decir, un segmento de gen V largo, un segmento génico de unión (J) corto y un segmento C. La cadena pesada se encuentra codificada por cuatro tipos de segmentos génicos de línea germinal, tres para la región variable y uno para la región constante. Los tres segmentos génicos de línea germinal que codifican la región variable de cadena pesada son: un segmento V, un segmento J y un segmento de diversidad (D) . Las secuencias génicas V, D y J de línea germinal humanas han sido caracterizadas. Los segmentos génicos de VH de línea germinal humana (estos "segmentos" también se denominan en la presente memoria "miembros de una familia") se clasifican en siete familias (VH1-VH7) basándose en una homología de secuencias de por lo menos 80% (ver, por ejemplo, Matsuda et al., J. Exp. Med. 188:2151-2162, 1998) . Existen aproximadamente cincuenta y un segmentos VH (miembros de familia) . Las primeras dos CDR y tres regiones de marco de las región variable de cadena pesada se encuentran codificadas por la VH. La CDR3 se encuentra codificada por unos cuantos nucleótidos de VH, la totalidad de DH y parte de JH, mientras que FR4 se encuentra codificada por el resto del segmento génico JH. Con respecto a las cadenas ligeras, los segmentos génicos V kappa (VK) o V lambda (VA) (miembros de familia) codifican las primeras dos CDR y tres regiones de marco de la región V, además de unos cuantos residuos de CDR3. Los segmentos J kappa (JK) y J lambda (JA) codifican el resto de la región CDR3 en una región VK o VA, respectivamente. El ADN codificante de la cadena K incluye aproximadamente cuarenta segmentos VK (miembros de una familia) que se clasifican en seis familias (VK I-VK VI) basándose en la homología de las secuencias. El ADN codificante de la cadena A incluye aproximadamente treinta y un segmentos VA (miembros de una familia) que se clasifican en diez familias. Ver las figuras 1, 2, 3 y 6.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se han convertido en prometedores agentes terapéuticos relacionados con diversas enfermedades humanas en contextos tanto agudos como crónicos. Se están utilizando varios métodos para generar anticuerpos, entre ellos la tecnología de hibridomas, la expresión en bacterias, la expresión ribosómica, la expresión en levaduras y la expresión recombinante de fragmentos de anticuerpo humanos sobre la superficie de bacteriófagos replicantes. Los anticuerpos monoclonales (mAb) , que pueden ser producidos por hibridomas, se han utilizado con éxito como herramientas diagnósticas durante muchos años, aunque su utilización como agentes terapéuticos está apenas iniciándose. La amplia mayoría de mAb son de origen no humano (mayoritariamente de roedor) , planteando el problema de la inmunogenicidad en el ser humano. Al administrar anticuerpos procedentes de roedor en el ser humano, se generan anticuerpos antirroedor que resultan en una mayor eliminación del anticuerpo de roedor del suero, bloqueo de su efecto terapéutico y reacciones de hipersensibilidad. Estas limitaciones han impulsado el desarrollo de tecnologías de ingeniería conocidas como "humanización".

Las primeras estrategias de humanización se basan en el conocimiento de que los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera son responsables de la unión a antígeno, mientras que los dominios constantes son

responsables de la función efectora. Se han creado anticuerpos quiméricos mediante, por ejemplo, el trasplante de los dominios variables de un mAb de roedor en los dominios constantes de anticuerpos humanos (por ejemplo Neuberger M.S. et al., Nature 314:268-70, 1985, y Takeda et al., Nature 314:452-4, 1985) . Aunque estos anticuerpos quiméricos inducen mejores funciones efectoras en el ser humano y muestran una inmunogenicidad reducida, la región variable de roedor todavía plantea un riesgo de inducción de una respuesta inmunológica. Al reconocer que los dominios variables consisten de un marco de hoja beta coronada por bucles de unión a antígeno (regiones determinantes de complementariedad, o CDR) , se diseñaron anticuerpos humanizados para contener las CDR de roedor injertadas en un marco humano. Se han transferido con éxito varios sitios de unión a antígeno diferentes a un único marco humano, con frecuencia utilizando un anticuerpo en el que las regiones de marco humanas completas presentan la homología máxima con la secuencia de roedor (por ejemplo Jones P.T. et al., Nature 321:522-5, 1986; Riechmann L. et al., Nature 332:323-327, 1988, y Sato K. et al., Mol. Immunol. 31:371-8, 1994) . Alternativamente, se han construido marcos humanos de consenso con varias cadenas pesadas humanas (por ejemplo Carter P. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:487-99, 1992) . Sin embargo, la simple injerción de CDR con frecuencia resulta en la pérdida de afinidad para el antígeno. Deben considerarse otras posibles interacciones entre el marco de hoja y los bucles durante la nueva creación del sitio de unión a antígeno (Chothia C. et al., Mol. Biol. 196:901-917, 1987) .

La comparación entre los residuos de marco esenciales que resultan necesarios para la humanización de diversos anticuerpos, así como el modelaje por ordenador basado en estructuras cristalinas de los anticuerpos han puesto de manifiesto la existencia de un conjunto de residuos de marco denominado "residuos de la zona Vernier" (Foote J. et al., Mol. Biol. 224:487-99, 1992) , que muy probablemente contribuye a la integridad del sitio de unión. Además, varios residuos en la zona de interfaz VH-VL podrían resultar importantes en el mantenimiento de la afinidad para el antígeno (Santos A.D. et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 60:169-94, 1998) . Inicialmente, los residuos de marco se retromutaron escalonadamente, formando la secuencia de roedor (Kettleborough C.A. et al., Protein Engin. 4:773783, 1991) . Sin embargo, este enfoque mutacional resulta muy laborioso y no puede cubrir todos y cada uno de los residuos importantes.

A continuación se proporcionan ejemplos de documentos que describen la humanización de diferentes anticuerpos: i) Qu Z. et al., "Humanization... [Seguir leyendo]

1. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido, que comprende:

proporcionar un anticuerpo inicial que presenta una especificidad para una diana;

determinar la secuencia de una región variable del anticuerpo inicial; y (i) seleccionar un primer componente de la región variable, comprendiendo dicho primer componente una región de 10 marco seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3;

comparar la secuencia del primer componente de la región variable con secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de una especie diana;

seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el primer componente;

determinar de qué familia génica de línea germinal se ha derivado la secuencia; 20

(ii) seleccionar un segundo componente de la región variable que es diferente del primer componente, comprendiendo el segundo componente una región de marco seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3;

comparar la secuencia del segundo componente con secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de la especie diana;

seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el segundo componente y que corresponde a la misma familia génica de línea germinal que la primera secuencia seleccionada 30 de la base de datos de la etapa (i) ;

(iii) seleccionar un tercer componente de la región variable que es diferente de los primer y segundo componentes, comprendiendo el tercer componente una región de marco seleccionada de entre el grupo constituido por FR1, FR2 y FR3;

comparar la secuencia del tercer componente con las secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpo o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de la especie diana;

seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el tercer 40 componente y que corresponde a la misma familia génica de línea germinal que la primera secuencia seleccionada de la base de datos de la etapa (i) ; y (iv) ligar operativamente las secuencias de marco seleccionadas con una o más CDR del anticuerpo inicial con el fin de producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido. 45

2. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, que comprende además seleccionar un cuarto componente de la región variable, comprendiendo dicho cuarto componente una región de marco que es la FR4;

50 comparar la secuencia del cuarto componente con las secuencias contenidas en una base de datos de referencia de secuencias de anticuerpos o de secuencias de fragmentos de anticuerpos procedentes de la especie diana;

seleccionar una secuencia de la base de datos que muestra un grado de homología elevado con el cuarto componente; y 55 ligar operativamente las secuencias de marco seleccionadas con una o más CDR del anticuerpo inicial con el fin de producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido.

3. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el 60 que el primer componente comprende además una CDR.

4. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que el segundo componente comprende además una CDR.

5. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que la región variable del anticuerpo inicial se selecciona de entre el grupo constituido por cadena pesada variable y cadena ligera variable.

6. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 2, en el que se produce un fragmento de anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por una cadena pesada variable y cadena ligera variable.

7. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el 10 que las secuencias seleccionadas de la base de datos de referencia son de anticuerpos diferentes.

8. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que dos o más de las secuencias seleccionadas de la base de datos de referencia son de anticuerpos diferentes.

9. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 2, en el que las secuencias seleccionadas de la base de datos de referencia son de anticuerpos diferentes.

10. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que las secuencias son secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos. 20

11. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que el fragmento de anticuerpo se selecciona de entre el grupo constituido por scFv, Fab, Fab', F (ab') 2, Fd, diacuerpos, cadenas ligeras de anticuerpo y cadenas pesadas de anticuerpo.

12. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que la especie diana es el ser humano.

13. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de la región FR1 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para buscar en la base de datos de referencia las secuencias que presentan un grado de homología elevado y la familia génica de línea germinal a la que pertenece se utiliza como la familia a la que corresponden las otras secuencias seleccionadas.

14. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de la región FR2 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para buscar en la base de datos de referencia las secuencias que presentan un grado de homología elevado y la familia génica de línea germinal a la que pertenece se utiliza como la familia a la que corresponden las otras secuencias seleccionadas.

15. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de la región FR3 del anticuerpo inicial se utiliza individualmente para buscar en la base de datos de referencia las secuencias que presentan un grado de homología elevado y la familia génica de línea germinal a la que pertenece se utiliza como la familia a la que corresponden las otras secuencias seleccionadas.

16. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que la base de datos de referencia contiene secuencias de la línea germinal o reorganizadas de la especie diana. 45

17. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que las secuencias seleccionadas corresponden al mismo miembro de la familia en la familia génica de la línea germinal.

50 18. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 1, en el que dos o más de las secuencias seleccionadas corresponden al mismo miembro de la familia en la familia génica de la línea germinal.

19. Método para producir un anticuerpo híbrido o un fragmento de anticuerpo híbrido según la reivindicación 2, en el 55 que dos o más de las secuencias seleccionadas corresponden al mismo miembro de la familia en la familia génica de la línea germinal.