Método para evaluar una respuesta inmunitaria en un receptor de trasplante,

que comprende las etapas de determinar un valor del marcador metabólico intracelular adenosina trifosfato (ATP) de dicha respuesta inmunitaria en una muestra de linfocitos de dicho receptor tras su exposición al mitógeno fitohemaglutinina (PHA) como estimulante;

comparar dicho valor con valores en un conjunto de referencia que comprende intervalos de valores del marcador metabólico intracelular ATP de respuestas inmunológicas para linfocitos; y evaluar dicha respuesta inmunitaria en dicho receptor basándose en una comparación realizada en dicha etapa de comparación, en el que dicho conjunto de referencia comprende intervalos de valores bajos, moderados o fuertes, en el que valores de dicho intervalo bajo son inferiores o iguales a 225 nanogramos de ATP por ml, valores de dicho intervalo moderado son superiores a 225 nanogramos de ATP por ml e inferiores a 525 nanogramos de ATP por ml, y valores de dicho intervalo fuerte son iguales o superiores a 525 nanogramos de ATP por ml.

Método para monitorizar la respuesta inmunitaria y predecir los desenlaces clínicos en receptores de trasplantes.

Campo de la invención

La invención se refiere generalmente a métodos para monitorizar la respuesta inmunitaria en un paciente que recibe fármacos inmunosupresores. En particular, la invención proporciona métodos basados en la medición de marcadores metabólicos de activación en células inmunitarias como indicador de la respuesta inmunitaria del paciente. Los métodos pueden usarse para predecir desenlaces clínicos y determinar ciclos de tratamiento para pacientes tales como receptores de trasplantes.

Antecedentes de la invención

Cada año, se estima que se realizan 55.000 trasplantes de órganos en todo el mundo.1 En conjunto, se estima que el número de receptores de órganos vivos es actualmente de más de 300.000. La mayoría de estos receptores de trasplantes seguirán tomando fármacos inmunosupresores durante el resto de sus vidas para prevenir episodios de rechazo. Se requieren dosis controladas de estos fármacos para prevenir la sobremedicación, lo que puede dejar al paciente susceptible a enfermedad oportunista, riesgo aumentado de cáncer o enfermedad cardiovascular y efectos de toxicidad farmacológica, o subdosificación, lo que puede conducir a supervivencia del injerto acortada debido a episodios de rechazo.

Los dos fármacos principales usados en el mantenimiento del trasplante son actualmente ciclosporina (Novartis) y tacrolimús1 (Fujisawa) . Estos fármacos son inhibidores de calcineurina, una enzima clave implicada en la activación de células T.2 Se realiza rutinariamente monitorización farmacoterapéutica (TDM) para estos dos fármacos inmunosupresores, tal como prescriben los fabricantes. Sin embargo, la cantidad el fármaco medida en la sangre no se correlaciona directamente con la dosis del fármaco administrado debido a las diferencias farmacocinéticas individuales.3 Además, el nivel de fármaco determinado mediante inmunoensayo no se correlaciona con la eficacia del fármaco inmunosupresor.4 Por tanto, el principal valor de estas pruebas de TDM es evitar niveles tóxicos y monitorizar el cumplimiento del paciente.

Actualmente no hay ningún método disponible para la evaluación directa del estado inmunitario en receptores de trasplantes.

Sumario de la invención

La invención objeto proporciona un método de monitorización de respuestas inmunitarias en un paciente que está evaluándose como receptor de órganos y/o está recibiendo al menos un fármaco inmunosupresor (véanse las reivindicaciones) . Este método conveniente y fiable incluye las etapas de analizar las respuestas inmunológicasde un conjunto o subconjunto de linfocitos a partir de una muestra de sangre determinando al menos un nivel de actividad funcional y comparándolo con las respuestas inmunológicas de linfocitos con niveles definidos de respuestas inmunológicas humanas (bajas, moderadas o fuertes) . Esta evaluación del estado inmunitario del paciente se basa en esta comparación. Las respuestas inmunitarias se establecen midiendo un componente intracelular que aumenta si las células han respondido a un estímulo.

En la invención, el paciente es un receptor de trasplante. Por ejemplo, el paciente puede ser un receptor de un trasplante de corazón, pulmones, riñón, páncreas, hígado, intestino delgado u otros órganos, tejidos o médula ósea. Puede administrarse al menos un fármaco inmunosupresor, por ejemplo, inhibidores de calcineurina, inhibidores enzimáticos, antimetabolitos, fármacos de reducción de linfocitos, corticosteroides u otros moduladores inmunitarios. También pueden administrarse combinaciones de fármacos. El efecto global de los fármacos sobre las respuestas inmunitarias puede medirse usando un ensayo que detecta aumentos en un componente intracelular, ATP, mediante estimulación con un mitógeno o antígeno y empleando entonces un ensayo de luciferasa.

Un aspecto de la invención es un método para predecir un desenlace clínico en un paciente de trasplante que está recibiendo ninguno o uno o más fármacos inmunosupresores. El método utiliza intervalos medidos de respuestas de linfocitos derivadas de una cohorte de individuos aparentemente sanos como medios de definición de intervalos normales de reactividades, e incluye las etapas de determinar al menos un valor de respuesta de linfocitos en una muestra de sangre de un paciente antes o después de la administración de fármaco (s) inmunosupresor (es) ; determinar si la respuesta de linfocitos de las células del paciente que recibe el fármaco inmunosupresor es superior o inferior al intervalo definido para individuos aparentemente sanos, o se encuentra dentro del mismo; y proporcionar una guía para la terapia y predecir desenlaces clínicos basándose en la comparación. Los estados o desenlaces clínicos que pueden predecirse incluyen rechazo de trasplantes, sobremedicación e infección. Por ejemplo, una respuesta de linfocitos que se encuentra en el intervalo bajo indica alta inmunosupresión y puede ser indicativa de sobremedicación que puede conducir a toxicidad orgánica, infección o, a largo plazo, cáncer. Una respuesta de linfocitos que se encuentra en el intervalo fuerte indica un estado poco inmunosuprimido, que puede ser indicativo de infección o un ciclo que conduce a rechazo del órgano. Alternativamente, una respuesta de linfocitos que se encuentra en el intervalo moderado puede indicar que se ha logrado la estabilidad de la respuesta inmunológica y que no se justifican cambios en el régimen terapéutico en ese momento.

Otro aspecto de la invención es usar el ensayo para monitorizar pacientes que están retirándose gradualmente del/de los fármaco (s) inmunosupresor (es) , o para medir el cumplimiento del paciente con las instrucciones de prescripción de la medicación.

También se describe un método (no reivindicado) para evaluar el impacto farmacodinámico (efecto fisiológico) de un fármaco inmunosupresor en un paciente sin trasplante. El método incluye las etapas de determinar un valor de una respuesta inmunitaria en al menos una muestra de linfocitos del paciente sin trasplante; comparar el valor con valores en un conjunto de referencia que comprende intervalos de valores de respuesta inmunológica para linfocitos; y evaluar el efecto farmacodinámico del fármaco inmunosupresor basándose en una comparación realizada en dicha etapa de comparación. El paciente sin trasplante puede estar recibiendo el fármaco inmunosupresor para un estado patológico tal como autoinmunidad, inflamación, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso o artritis reumatoide. El método se llevará a cabo normalmente para reducir complicaciones de infecciones o cáncer en el paciente sin trasplante (no reivindicado) .

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Ilustra esquemáticamente un ensayo de función de células inmunitarias tal como se expone en la patente estadounidense 5.773.232. Se estimulan linfocitos, se incuban y se separan células CD4+ mediante separación magnética; se lavan las células y se lisan para liberar ATP, que se detecta.

Figura 2: Distribuciones de respuestas inmunitarias de adultos aparentemente sanos, receptores de trasplantes y pacientes con VIH. Eje Y = ATP (ng/ml) . Se indican las zonas de respuesta inmunitaria baja (: 225 ng/ml de ATP) , moderada (>225 ng/ml de ATP y >525 ng/ml de ATP) y fuerte (º525 ng/ml de ATP) .

Figura 3: Comparación de respuestas inmunitarias funcionales en tres centros. Eje Y = ATP (ng/ml) .

Figura 4: Comparación de la respuesta de la función de células inmunitarias CylexT en receptores de riñón, hígado y páncreas y páncreas y riñón simultáneos (SPK) . Eje Y = ATP (ng/ml) .

Figura 5. Respuesta inmunitaria frente a la monitorización farmacoterapéutica valle de tacrolimús. Eje X = concentración de tacrolimús (ng/ml) ; eje Y = ATP (ng/ml) .

Figura 6. Intervalo de respuesta de células inmunitarias frente al tiempo desde el trasplante. El eje Y sigue el tiempo desde el trasplante; el eje X es el % de población.

Figura 7: Estudio de caso 1: rechazo asociado con la función de células inmunitarias a pesar del recuento de linfocitos reducido tras la terapia de inducción. Eje X = tiempo (días) ; eje Y izquierdo, respuesta inmunitaria (ATP ng/ml) ; eje Y derecho = número de linfocitos.

Figura 8: Estudio de caso 2. Duración de la terapia de rescate mediante la medición de la función inmunitaria. Eje X = tiempo en semanas; eje Y = respuesta inmunitaria... [Seguir leyendo]

1. Método para evaluar una respuesta inmunitaria en un receptor de trasplante, que comprende las etapas de determinar un valor del marcador metabólico intracelular adenosina trifosfato (ATP) de dicha respuesta inmunitaria en una muestra de linfocitos de dicho receptor tras su exposición al mitógeno fitohemaglutinina (PHA) como estimulante;

comparar dicho valor con valores en un conjunto de referencia que comprende intervalos de valores del marcador metabólico intracelular ATP de respuestas inmunológicas para linfocitos; y evaluar dicha respuesta inmunitaria en dicho receptor basándose en una comparación realizada en dicha etapa de comparación, en el que dicho conjunto de referencia comprende intervalos de valores bajos, moderados o fuertes, en el que valores de dicho intervalo bajo son inferiores o iguales a 225 nanogramos de ATP por ml, valores de dicho intervalo moderado son superiores a 225 nanogramos de ATP por ml e inferiores a 525 nanogramos de ATP por ml, y valores de dicho intervalo fuerte son iguales o superiores a 525 nanogramos de ATP por ml.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de determinación se lleva a cabo proporcionando una muestra de sangre de dicho pacientes antes de o tras la administración de al menos un fármaco inmunosupresor, exponiendo dicha muestra de sangre a PHA como estimulante, seleccionando un conjunto o subconjunto de linfocitos de dicha muestra de sangre y midiendo un nivel de un marcador metabólico intracelular en dichos linfocitos.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicho ATP se mide mediante un ensayo de luciferasa.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicho método se lleva a cabo antes, después, o antes y después de la administración de al menos un fármaco inmunosupresor a dicho paciente.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho al menos un fármaco inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en inhibidores de calcineurina, inhibidores enzimáticos, antimetabolitos, fármacos de reducción de linfocitos, corticosteroides y moduladores inmunitarios.

6. Método según la reivindicación 2, en el que dicha muestra de sangre es sangre completa.

7. Método según la reivindicación 1, en el que dicho receptor es un receptor de un trasplante seleccionado del grupo que consiste en corazón, pulmones, riñón, páncreas, hígado, intestino delgado, piel, tejidos o médula ósea.

8. Método para predecir un desenlace clínico o determinar un ciclo de tratamiento en un paciente de trasplante, en el que se administra al menos un fármaco inmunosupresor a dicho paciente, que comprende las etapas de determinar un valor de ATP como marcador metabólico intracelular de dicha respuesta inmunitaria en al menos una muestra de linfocitos de dicho paciente tras su exposición al mitógeno fitohemaglutinina (PHA) como estimulante;

comparar dicho valor con valores en un conjunto de referencia que comprende intervalos de valores del marcador metabólico intracelular de respuesta inmunológica para linfocitos; y predecir dicho desenlace clínico o determinar dicho ciclo de tratamiento para dicho paciente basándose en una comparación realizada en dicha etapa de comparación, en el que dicho conjunto de referencia comprende intervalos de valores bajos, moderados o fuertes, en el que valores de dicho intervalo bajo son inferiores o iguales a 225 nanogramos de ATP por ml, valores de dicho intervalo moderado son superiores a 225 nanogramos de ATP por ml e inferiores a 525 nanogramos de ATP por ml, y valores de dicho intervalo fuerte son iguales o superiores a 525 nanogramos de ATP por ml.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicho valor se obtiene a partir de una pluralidad de muestras de linfocitos.

10. Método según la reivindicación 8, en el que dicha etapa de determinación se lleva a cabo proporcionando una muestra de sangre de dicho paciente antes o después de la administración de al menos un fármaco inmunosupresor,

exponiendo dicha muestra de sangre a PHA como estimulante, seleccionando un conjunto o subconjunto de linfocitos de dicha muestra de sangre, y midiendo un nivel de un marcador metabólico intracelular en dichos linfocitos.

11. Método según la reivindicación 8, en el que dicho ATP se mide mediante un ensayo de luciferasa.

12. Método según la reivindicación 8, en el que dicho al menos un fármaco inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en inhibidores de calcineurina, inhibidores enzimáticos, antimetabolitos, fármacos de reducción de linfocitos, glucocorticoides y moduladores inmunitarios.

13. Método según la reivindicación 8, en el que dicho desenlace clínico se selecciona de rechazo de trasplante, sobremedicación, infección o estabilidad.

14. Método según la reivindicación 8, llevándose a cabo dicho método durante una fase de retirada gradual de dicho paciente de dicho al menos un fármaco inmunosupresor.

15. Método según la reivindicación 8, llevándose a cabo dicho método para establecer el cumplimiento con las medicaciones por dicho paciente.

16. Método para monitorizar una respuesta inmunitaria en un paciente de trasplante antes de o que recibe actualmente al menos un fármaco inmunosupresor, que comprende las etapas de determinar un valor de ATP como marcador metabólico intracelular de respuesta inmunológica en una única muestra de linfocitos tras la exposición al mitógeno fitohemaglutinina (PHA) como estimulante de dicho pacientes antes o después de la administración de al menos un fármaco inmunosupresor;

comparar dicho valor de los linfocitos muestreados con un conjunto de referencia que tiene intervalos definidos de respuestas inmunológicas humanas a diversos niveles de reactividad de linfocitos; y evaluar dicha respuesta inmunitaria en dicho paciente basándose en una comparación realizada en dicha etapa de comparación, en el que valores de dicho intervalo bajo son inferiores o iguales a 226 nanogramos de ATP por ml, valores de dicho intervalo moderado son superiores a 225 nanogramos de ATP por ml e inferiores a 525 nanogramos de ATP por ml, y valores de dicho intervalo fuerte son iguales o superiores a 526 nanogramos de ATP por ml.

17. Método para predecir un desenlace clínico o ciclo de tratamiento en un paciente antes de recibir al menos un fármaco inmunosupresor, según reivindicación 8, que comprende las etapas de determinar un valor de ATP como marcador metabólico intracelular de respuesta inmunológica de un conjunto o subconjunto de linfocitos en una única muestra de sangre tras la exposición al mitógeno fitohemaglutinina (PHA) como estimulante de dicho paciente antes o después de la administración de dicho al menos un fármaco inmunosupresor;

comparar dicho valor de los linfocitos muestreados con un conjunto de referencia que tiene intervalos definidos de respuesta inmunológica humana a diversos niveles de reactividad de linfocitos; y predecir dicho desenlace clínico o determinar dicho ciclo de tratamiento para dicho paciente basándose en una comparación realizada en dicha etapa de comparación.

18. Método para predecir un desenlace clínico o ciclo de tratamiento en un paciente que recibe al menos un fármaco inmunosupresor según la reivindicación 8, que comprende las etapas de determinar un valor de ATP como marcador intracelular de una respuesta inmunológica de una muestra de linfocitos de dicho paciente antes de la administración de cualquier fármaco y al menos una muestra de linfocitos adicional de dicho paciente tras recibir dicho al menos un fármaco inmunosupresor tras la exposición al mitógeno fitohemaglutinina (PHA) como estimulante;

comparar dichos valores de los linfocitos muestreados con un conjunto de referencia que tiene intervalos definidos de respuesta inmunológica humana a diversos niveles de reactividad de linfocitos y entre sí; y predecir dicho desenlace clínico o determinar dicho ciclo de tratamiento para dicho paciente basándose en una comparación realizada en dicha etapa de comparación.

19. Método para predecir un desenlace clínico o ciclo de tratamiento en un paciente que recibe al menos un fármaco inmunosupresor según la reivindicación 8, que comprende las etapas de determinar un valor de ATP como marcador metabólico intracelular de una respuesta inmunológica tras la exposición al mitógeno fitohemaglutinina (PHA) como estimulante de dos o más muestras de linfocitos recogidas a lo largo del tiempo de dicho paciente tras recibir al menos un fármaco inmunosupresor;

comparar dichos valores de los linfocitos muestreados con un conjunto de referencia que tiene intervalos definidos de respuesta inmunológica humana a diversos valores de reactividad de linfocitos y entre sí; y predecir dicho desenlace clínico o determinar ciclo de tratamiento para dicho paciente basándose en una comparación realizada en dicha etapa de comparación.

20. Método de determinación de un riesgo de rechazo en un paciente que ha recibido un trasplante que comprende monitorizar la respuesta inmunitaria en dicho paciente que comprende las etapas de determinar los valores de ATP como marcador metabólico intracelular de dicha respuesta inmunitaria tras la exposición al mitógeno fitohemaglutinina (PHA) como estimulante en muestras de linfocitos de dicho paciente, comparar dichos valores obtenidos a lo largo de un periodo de tiempo de varios días y si hay un aumento en el intervalo de al menos 50 nanogramos/ml de ATP, determinar que dicho paciente corre el riesgo de rechazo.

21. Método de determinación de la sobremedicación en un paciente que ha recibido un trasplante que comprende monitorizar la respuesta inmunitaria en dicho paciente que comprende las etapas de determinar los valores de ATP como marcador metabólico intracelular de dicha respuesta inmunitaria en una muestra de linfocitos tras la exposición al mitógeno fitohemaglutinina (PHA) como estimulante de dicho paciente; comparar dichos valores obtenidos a lo largo de un periodo de tiempo de varios días y, si hay una disminución de al menos 50 nanogramos/ml de ATP, determinar que dicho paciente corre el riesgo de sobremedicación.