Método para mejorar la tolerancia de las plantas al estrés ambiental.

Un ácido nucleico que codifica una proteína DBF1 de una planta o un fragmento de la misma capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE seleccionada del grupo de:

(a) ácido nucleico que contiene la secuencia de ADN como la presentada en la SEQ ID NO 2,

(b) ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como la presentada en la SEQ ID NO 3,

(c) un fragmento del ácido nucleico de (a), que codifica una proteína de al menos 50 aminoácidos de longitud capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE, y

(d) un fragmento del ácido nucleico de (b) que codifica una proteína de al menos 50 aminoácidos de longitud capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE.

Metodo para mejorar la tolerancia de las plantas al estres ambiental. Campo de la invencion

La presente solicitud se refiere en general a un metodo para mejorar la tolerancia de las plantas al estres ambiental, incluyendo pero sin limitarse a estres por sequia, y/o salinidad, y/o deshidratacion, y/o calor, y/o frio, y/o congelacion, y/o anegacion, y/o lesiones, y/o estres mecanico, y/o estres oxidativo, y/u ozono, y/o luz alta, y/o metales pesados, y/o privacion de nutrientes, y/o productos quimicos toxicos y/o patogeno (incluyendo virus, bacterias, hongos, insectos y nematodos) y/o combinaciones de los mismos, dicho metodo comprendiendo la expresion de una proteina de enlzamiento de DRE regulada por acido abscicico (ABA) , de la familia del factor de transcripcion AP2/EREBP, tal como DBF1 del maiz, en la planta, operativamente bajo el control de una secuencia del promotor constitutiva o regulable tal como un promotor inducible por estres, un promotor especifico de la celula, un promotor especifico del tejido, o secuencia del promotor especifica del organo. Preferiblemente, las caracteristicas modificadas por la presente invencion se relacionan con crecimiento, y/o rendimiento, y/o con supervivencia bajo condiciones de crecimiento por debajo del optimo. La presente invencion se extiende a constructos geneticos, que son utiles para llevar a cabo el metodo de la invencion y para las plantas transgenicas producidas con el mismo que tienen propiedades alteradas de crecimiento y/o rendimiento, y/o de supervivencia en comparacion con sus contrapartes isogenicas.

Antecedentes de la invencion El crecimiento, la produccion de biomasa, el rendimiento, el desarrollo, la morfologia y la supervivencia de las plantas esta determinada por las condiciones de crecimiento. Los factores que afectan estas caracteristicas de importancia agricola incluyen, entre otros, la disponibilidad de agua, minerales y nutrientes, temperatura, intensidad de luz, la presencia de competidores o patogenos, y de suciedad o la contaminacion del aire. En agricultura, las condiciones de crecimiento por debajo del optimo a menudo se puede remediar. Por ejemplo, los suelos secos se irrigan, los suelos pobres se fertilizan, mientras se aplican pesticidas y herbicidas para controlar plagas de patogenos y competidores, respectivamente. Sin embargo, la preocupacion creciente por una agricultura sostenible y respetuoso con el medio ambiente demanda cambios en las practicas agricolas. La irrigacion masiva de tierras de cultivo, comunmente utilizada para el cultivo de algodon y de otros cultivos, esta siendo cada vez menos aceptada porque conduce a la salinizacion de los suelos y a la reduccion de los niveles de agua en zonas bajas. Del mismo modo, el uso intensivo de agroquimicos es fuertemente criticado, debido a presuntos efectos negativos para el bienestar de los seres humanos y los animales. Al mismo tiempo, la creciente poblacion mundial esta obligando a la agricultura al uso de tierras marginales, lo que amplia el rango de ambientes en los cuales se siembran cultivos. Como resultado de esto, la produccion de variedades tolerantes al estres se ha convertido en una prioridad en todo el mundo para la mayoria de los cultivos importantes. Aunque los programas convencionales de fitomejoramiento han mejorado los rendimientos de los cultivos en ambientes estresantes, hay una creencia cada vez mayor de que se obtendran ganancias adicionales principalmente a traves de la manipulacion dirigida de los genes involucrados en la tolerancia al estres. Se han identificado muchos genes inducibles por estres en los ultimos aros, algunos de los cuales han demostrado que confieren un cierto aumento de la tolerancia al estres, cuando se sobreexpresan en las plantas transgenicas. Sin embargo, a partir de estos estudios surgio la idea de que la tolerancia al estres ambiental es altamente compleja, que requiere de una activacion coordinada de multiples genes. Esto ha llevado a la adopcion de estrategias transgenicas que hacen uso de componentes de transduccion de serales que controlan la expresion o la actividad de proteinas para defenderse del estres, mas que de las proteinas para defenderse del estres en si mismas. Ejemplos exitosos de este tipo son la sobreexpresion de factores de transcripcion del dominio AP2, CBF1 y DREB1 A, y de los factores de choque termico HSF1 y 3 en Arabidopsis. CBF1 ha demostrado que mejora la tolerancia a la congelacion (Jaglo-Ottosen et al., Science 280: 104 - 106, 1998; Thomashow, patente de los Estados Unidos No. 5.929.305) , mientras que la tolerancia al estres por frio y sequia inducida por DREB1A (Kasuga et al., Nature Biotechnol 19: 287 - 291, 1999) en Arabidopsis. HSF1 y 3, confieren ambos tolerancia al calor en plantas transgenicas (Lee y Schoffl, Plant J 8: 603 - 612, 1995; Prandl et al., Mol Gen Genet 258: 269 - 278, 1998) . Resumen de la invencion La presente invencion incluye una secuencia aislada de ADN con una secuencia de nucleotidos tal como la presentada en la SEQ ID NO 2, que codifica al factor de transcripcion con una secuencia de aminoacidos como la presentada en la SEQ ID NO 3, que es capaz de enlazarse al elemento regulador cis DRE2 del promotor Rab17 del maiz. Este factor de transcripcion pertenece a un nuevo tipo de factores de transcripcion que contienen el dominio AP2 y se denominan adicionalmente como DBF1. Se muestran en la presente invencion que DBF1 y el elemento DRE2 median la respuesta del acido abscisico (ABA) en las plantas. ABA es una hormona de las plantas implicada en muchos procesos de las mismas, entre los cuales estan la induccion de tolerancia al estres. Es la primera vez

que se establece un vinculo entre una proteina sensible a ABA o una ruta sensible a ABA y un elemento que actua sobre cis en DRE. Ademas, este enlace se establece por medio de la identificacion de una proteina de enlazamiento DRE que, sorprendentemente, pertenece a la clase de proteina que contiene el dominio AP2, de cuyos miembros anteriormente conocidos estan todos involucrados de manera independiente de ABA.

La presente invencion incluye tambien metodos para identificar proteinas de maiz y de otras plantas que pueden unirse el elemento regulador DRE2, asi como los metodos para identificar las proteinas y los compuestos que interactuan con DBF1.

Una primera realizacion de la presente invencion comprende una secuencia aislada de acido nucleico que codifica una proteina DBF1 de la planta o un fragmento de la misma de al menos 50 aminoacidos de longitud capaz de enlazarse a una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE seleccionada del grupo que consiste de:

(a) acido nucleico que comprende la secuencia de ADN, como la representada en la SEQ ID NO 2, y

(b) acido nucleico que codifica una proteina que comprende una secuencia de aminoacidos como la representada en la SEQ ID NO 3.

Incorporada en la presente invencion estan tambien metodos para modificar la tolerancia al crecimiento, el rendimiento, y el estres de las plantas, que comprende la modificacion de la expresion en celulas, tejidos u organos particulares de una planta, de una secuencia de acido nucleico como la definida anteriormente, expresada bajo el control de un promotor constitutivo y/o ubicuo o regulado. El promotor regulado puede ser controlado por factores sensibles al estres o especificos de celulas / tejidos / organos.

La presente invencion se refiere tambien a una celula o planta que contiene dicho constructo genetico.

La presente invencion ademas abarca metodos para modificar el crecimiento, el rendimiento y la tolerancia al estres de las plantas, que comprende la modificacion de la expresion de secuencias de DBF1 como se describio anteriormente.

Descripcion detallada de la invencion

El estres por deshidratacion es probablemente el estres abiotico mas importante en la agricultura. Una celula padece estres por deshidratacion cuando experimenta una escasez de agua. Por lo general, esta situacion se produce como consecuencia de la sequia. Sin embargo, tambien el estres por sal y frio (en particular congelacion) conducen a estres por deshidratacion a nivel celular. Ademas, cualquier lesion del tejido (como consecuencia de heridas, tension mecanica, patogenos) , asi como el calor, puede conducir a una mayor evaporacion del agua y por lo tanto a estres por deshidratacion. La perdida de agua a nivel celular tambien puede ocurrir como resultado de daro de la membrana, por ejemplo como consecuencia de la peroxidacion de lipidos durante el estres oxidativo.

La hormona vegetal acido abscisico (ABA) juega un papel importante en la proteccion... [Seguir leyendo]

1. Un acido nucleico que codifica una proteina DBF1 de una planta o un fragmento de la misma capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE seleccionada del grupo de:

(a) acido nucleico que contiene la secuencia de ADN como la presentada en la SEQ ID NO 2,

(b) acido nucleico que codifica una proteina que comprende una secuencia de aminoacidos como la presentada en la SEQ ID NO 3,

(c) un fragmento del acido nucleico de (a) , que codifica una proteina de al menos 50 aminoacidos de longitud capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE, y

(d) un fragmento del acido nucleico de (b) que codifica una proteina de al menos 50 aminoacidos de longitud capaz de enlazarse con una secuencia de ADN reguladora de cis en DRE.

2. El acido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicacion 1, que es ADNc, ADN, ADN genomico o ADN sintetico,

o ARN en donde T es reemplazado por U.

3. El acido nucleico aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que se deriva de una planta monocotiledonea.

4. Un polipeptido codificado por un acido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector que comprende una secuencia de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a

3.

6. El vector de la reivindicacion 5, que es un vector de expresion, en donde dicha secuencia de acido nucleico esta operativamente enlazada a una o mas secuencias de control que permite la expresion en celulas huesped procariotas y/o eucariotas.

7. Una celula huesped que contiene un transgen DBF1 que contiene una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6.

8. Una celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 7 seleccionada del grupo que consiste de una celula bacteriana, de insecto, de hongo, de una planta o animal.

9. Una celula de una planta transgenica que comprende un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6.

10. La celula de una planta transgenica de la reivindicacion 9 en donde dicha secuencia de acido nucleico o dicho vector se integra en forma estable en el genoma de la celula de la planta.

11. Una planta transgenica, un tejido de una planta o una parte de una planta que comprende una celula de una planta de la reivindicacion 9 o 10.

12. Un metodo para la produccion de una planta transgenica, celula de una planta, parte de una planta o tejido de una planta que comprende la introduccion de un acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6 en una planta, celula de una planta, parte de una planta o tejido de una panta.

13. El metodo de la reivindicacion 12 comprende ademas la regeneracion de una planta a partir de dicha celula de la planta, parte de la planta o tejido de la planta.

14. Un metodo para incrementar el crecimiento y/o el rendimiento de una planta bajo condiciones estresadas y/o no estresadas, dicho metodo comprendiendo la introduccion de un acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6 en una celula de una planta, parte de una planta o tejido de una planta.

15. La planta, tejido de la planta o parte de la planta transgenica de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde dicha planta es una planta monocotiledonea o una planta dicotiledonea.

16. Una parte cosechable o propagulo derivados de una planta o tejido de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 11 o 15, dicha parte cosechable o propagulo comprendiendo un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6.

17. La parte cosechable de acuerdo con la reivindicacion 16, que se selecciona del grupo que consiste de semillas,

hojas, raices, flores, frutos, tallos, rizomas, tuberculos y bulbos, dicha parte cosechable comprendiendo un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o

6.

18. La progenie derivada de cualquiera de las plantas, tejidos de las plantas o partes de las plantas de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 o las reivindicaciones 15 a 17, dicha progenie comprendiendo un transgen DBF1 que contiene un acido nucleico de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6.

19. Un metodo para identificar polipeptidos que interactuan con un polipeptido de la reivindicacion 4, que comprende un ensayo de seleccion de doble hibrido en donde al menos un polipeptido de la reivindicacion 4 se usa como cebo y en donde una biblioteca de ADNc de una planta o parte de una planta se usa como presa.

SEQ ID NO 1 Contiene tres repeticiones en tandem del elemento DRE2 (subrayado) usado como cebo en la seleccion de un hibrido (Ejemplo 1; Busk et al. 1997)

SEQ ID NO 2 Secuencia de nucleotidos de DBF1 1043 nucleotidos Secuencia de ADN Zea mays

FIGURA 8

SEQ ID NO 3 SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE DBF1 222 AMINOACIDOS SECUENCIA DE PROTEINA Zea mays

SECUENCIA CONSERVADA DE PEPTIDOS ENTRE DBF1 Y PROTEINAS RELACIONADAS

(X = CUALQUIER AMINOACIDO NATURAL) FIGURA 8 (continuacion)

FIGURA 8 (continuacion)