Método para la micropropagación de monocotiledóneas basado en cultivos celulares totipotentes continuos.

Procedimiento para incrementar la velocidad de crecimiento de una masa celular embriogénica de un cultivocelular embriogénico totipotente de una familia de hierba monocotiledónea o de una planta de junco en operacionesa escala industrial,

que comprende:

(a) cultivar un explante de tejido del ápice caulinar de la planta monocotiledónea en un medio primario, en el queel explante se había tratado previamente con una temperatura fría y el medio primario comprende auxina oauxina y citocinina, para producir un cultivo celular embriogénico totipotente;

(b) tratar el cultivo celular embrionario totipotente con una temperatura fría para incrementar la velocidad decrecimiento de la masa del cultivo celular embrionario totipotente continuo en comparación con un control, en elque el tratamiento con una temperatura fría es para que dure de 30 días a 325 días y comprende unatemperatura en un margen de 4 ºC a 10 ºC; y

(c) mantener el cultivo celular embriogénico totipotente mediante el cultivo adicional en el medio primario y/o enun medio secundario, mediante el cual se produce un cultivo de una planta monocotiledónea que tiene unamayor velocidad de crecimiento de la masa celular embriogénica con una velocidad de multiplicación de 5x a 8xen comparación con 2x a 3x para un control sin el tratamiento con frío.

Método para la micropropagación de monocotiledóneas basado en cultivos celulares totipotentes continuos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos métodos para la micropropagación a gran escala de plantas de la clase Monocotyledoneae.

Antecedentes de la invención

La regeneración de plantas a partir de células cultivadas de la gran mayoría de especies de monocotiledóneas (principalmente las gramíneas) que se han descrito hasta ahora se consigue de callos iniciados a concentraciones elevadas de una auxina potente, tal como el ácido 2, 4-diclorofenoxiacético (2, 4-D) (Conger, B. V. et al., Current issues in plant molecular and cellular biology, págs. 59-68 (1995) ) . La auxina sintética, el 2, 4-D, se considera que es la mejor hormona vegetal para inducir el callo embriogénico. El callo embriogénico se obtiene típicamente de las monocotiledóneas mediante la inducción del cultivo celular primario en un medio que contiene una o más hormonas vegetales de tipo auxina seguido de una etapa de cultivo secundario en menos cantidad de auxina, pero en presencia de una hormona vegetal de tipo citocinina. El potencial embriogénico de los cultivos celulares de las monocotiledóneas disminuye con el tiempo, lo que hace necesario el reinicio del cultivo celular primario (patente de los Estados Unidos n.º 6 153 812 expedida el 28 de noviembre de 2000; Trigiano y Gray, Plant tissue culture concepts and laborator y exercises. 2.ª ed., Boca Raton: CRC Press (2000) ) .

Las plantas de la clase Monocotyledoneae a menudo son plantas que se dedican a varios usos. La caña común (Arundo donax) , por ejemplo, se ha utilizado durante 5000 años para construir instrumentos con tubos y es la fuente de caña para los clarinetes y los tubos de los órganos. Incluso con la tecnología moderna de hoy en día, la mayor parte de las cañas para los instrumentos musicales de viento todavía se fabrican de los tallos de A. donax.

La caña común también se utiliza para el control de la erosión y tiene un gran potencial para uso como cultivo para energía (Szabo, P et al., J. Anal. Appl. Pyrolysis, 36: 179-190 (1996) ) . Los tallos también se utilizan para las cañas de pesca, bastones para caminar, celosías y esterillas en la construcción de cabañas de adobe. La caña común también es una fuente de celulosa industrial para la fabricación de papel y rayón, y para la producción de otros polisacáridos (Neto, C. P. et al., Ind. Crops & Prods., 6: 51-58 (1997) ) . Incluso se la ha considerado una fuente de pasta para fabricar papel. Adicionalmente, la caña común también se puede utilizar en los intentos de biorremediación para retirar los contaminantes medioambientales del agua y de superficies terrestres.

La caña común es sólo una de las muchas monocotiledóneas que muestran tal multitud de usos. Tanto si se utiliza como decoración, como fuente de energía o como vehículo útil para llevar a cabo procesos industriales, tales plantas de tipo herbáceo son importantes.

Los presentes inventores han encontrado que los cultivos de callos inducidos con 2, 4-D obtenidos de segmentos nodales de la caña común y de segmentos de inflorescencias inmaduras no consiguen mantener la producción de cultivos celulares embriogénicos ni de embriones incluso después de transferirlos a auxina en baja concentración o sin auxina en combinación con una citocinina, que es lo que se suele poner en práctica (patente de los Estados Unidos n.º 6 153 812 expedida el 28 de noviembre de 2000; Trigiano y Gray, Plant culture concepts and laborator y exercises. 2.ª ed., Boca Raton: CRC Press (2000) ) . El hallazgo de que estos métodos no consiguen producir cultivos embriogénicos lo corroboran Tóth y Mix-Wagner, y Linder y Gallagher, en donde Tóth y Mix-Wagner describieron la formación de callos que se reivindicó que eran embriogénicos, pero sin conseguir la obtención de embriones ni la regeneración vegetal, y Linder y Gallagher anunciaron la antigua regeneración vegetal a partir de callos sin el potencial para la propagación de masa (Tóth y Mix-Wagner, Sustainable agriculture for food, energy and industr y : strategies towards achievement: proceedings of the international conference held in Braunshweig, Alemania, junio de 1997, N. El Bassarn et al., eds. James y James (Science Publishers) Ltd: Londres, págs. 249-253 (1998) ; Linder y Gallagher, resumen n.º 257, American Journal of Botany, 85 (6) : 89 (1998) ) . Liu, J. Plant Physiol., 141, 714-720; (1993) , describe un tratamiento de conservación en frío de precultivos para la caña de azúcar que mejoró la frecuencia de los callos.

Por consiguiente, sería útil disponer de métodos para la micropropagación y la macropropagación a gran escala de Arundo donax y de otras plantas monocotiledóneas. Por lo tanto, la presente invención da a conocer un conjunto completo de métodos para producir, propagar, mantener, conservar, transportar y desplegar cultivos celulares embriogénicos continuos, así como cultivos secundarios y terciarios de tejidos totipotentes procedentes de especies vegetales de la clase Monocotyledoneae y de las líneas vegetales de élite derivadas de la misma. La tecnología de micropropagación vegetal de la presente invención basada en los cultivos embriogénicos continuos proporciona una eficiencia sin precedentes.

Compendio de la invención

La presente invención da a conocer un conjunto completo de métodos para el inicio, micropropagación de masa, mantenimiento, conservación, transporte y/o despliegue de propágulos. La presente invención da a conocer además métodos para mejorar mejora genética somaclonal de la familia de hierbas monocotiledóneas y especies vegetales de junco mediante la tecnología de inducción y mantenimiento del cultivo celular embriogénico continuo que se describe en la presente memoria. Por lo tanto, los métodos de la presente invención pueden proporcionar clones vegetales mejores en cantidades comercialmente viables a escala industrial que se pueden utilizar para muchos propósitos, entre ellos la remediación y las plantaciones para biomasa. Así pues, la presente invención da a conocer adicionalmente métodos para la producción rentable de masa a escala industrial de propágulos listos para que produzcan en el campo plantas monocotiledóneas de la familia de las herbáceas y de los juncos mediante una tecnología basada en un único subcultivo o varios subcultivos a partir de cultivos celulares embriogénicos.

Por consiguiente, una realización de la presente invención es un método para incrementar la velocidad de crecimiento de una masa celular embriogénica de un cultivo celular embriogénico totipotente de una familia de hierbas monocotiledóneas o de la planta de junco en operaciones a escala industrial, que comprende:

(a) cultivar un explante de tejido del ápice caulinar de una planta monocotiledónea en un medio primario, en donde el explante se ha tratado previamente a temperatura fría y el medio primario comprende auxina, o auxina y citocinina, para producir un cultivo celular embriogénico totipotente;

(b) tratar el cultivo de células embrionarias totipotentes en frío para incrementar la velocidad de crecimiento de la masa del cultivo celular embrionario totipotente continuo en comparación con un control, en donde se trata en frío de 30 días a 325 días y comprende una temperatura en el intervalo de 4ºC a 10ºC; y

(c) mantener el cultivo celular embriogénico totipotente para cultivarlo posteriormente en el medio primario y/o en un medio secundario, mediante lo cual se produce un cultivo de una planta monocotiledónea que tiene incrementada la velocidad de crecimiento de la masa celular embriogénica con una velocidad de multiplicación de 5x a 8x en comparación con 2x a 3x para un control sin tratamiento con frío.

Una realización más da a conocer un método para micropropagar una planta de la familia de la hierbas monocotiledóneas o una planta de junco que comprende las etapas (a) , (b) y (c) descritas más arriba y (d) transferir el cultivo celular embriogénico de la etapa (c) a un medio terciario para continuar la multiplicación y producir una plántula con raíz y vástago, por lo que se micropropaga una planta monocotiledónea.

En otras realizaciones más, se da a conocer un método de micropropagación de una planta monocotiledónea que comprende una planta de la familia de las hierbas o de los juncos, que comprende las etapas (a) , (b) y (c) descritas... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para incrementar la velocidad de crecimiento de una masa celular embriogénica de un cultivo celular embriogénico totipotente de una familia de hierba monocotiledónea o de una planta de junco en operaciones a escala industrial, que comprende:

(a) cultivar un explante de tejido del ápice caulinar de la planta monocotiledónea en un medio primario, en el que el explante se había tratado previamente con una temperatura fría y el medio primario comprende auxina o auxina y citocinina, para producir un cultivo celular embriogénico totipotente;

(b) tratar el cultivo celular embrionario totipotente con una temperatura fría para incrementar la velocidad de crecimiento de la masa del cultivo celular embrionario totipotente continuo en comparación con un control, en el que el tratamiento con una temperatura fría es para que dure de 30 días a 325 días y comprende una temperatura en un margen de 4 ºC a 10 ºC; y

(c) mantener el cultivo celular embriogénico totipotente mediante el cultivo adicional en el medio primario y/o en un medio secundario, mediante el cual se produce un cultivo de una planta monocotiledónea que tiene una mayor velocidad de crecimiento de la masa celular embriogénica con una velocidad de multiplicación de 5x a 8x en comparación con 2x a 3x para un control sin el tratamiento con frío.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la planta monocotiledónea se selecciona entre el grupo que consiste en Arundo spp., Thysanolaena spp., Miscanthus spp., y Scirpus spp., y combinaciones de las mismas.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que además comprende micropropagar una planta monocotiledónea, comprendiendo el método la transferencia del cultivo celular embriogénico de la etapa (c) a un medio terciario para continuar la multiplicación y producir una plántula con raíz y vástago.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, que además comprende aclimatar la plántula mediante la transferencia de la plántula bien a un medio cuaternario o bien directamente a suelo para la aclimatación en condiciones fotosintéticas y sin esterilidad, lo que produce una plántula o planta aclimatada.

5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo celular embriogénico se conserva, transporta y rehabilita para la producción de propágulos.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la auxina del medio primario se selecciona entre el grupo que consiste en ácido 2, 4-diclorofenoxiacético, ácido indolbutírico y picloram, y cualquier combinación de los mismos, y la citocinina del medio primario se selecciona entre el grupo que consiste en hemisulfato de adenina, dimetilaliladenina, zeatina, benciladenina, cinetina y tidiazurón, y cualquier combinación de los mismos.

7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio secundario comprende auxina y citocinina.

8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que el medio terciario comprende citocinina, en el que además la citocinina se selecciona entre el grupo que consiste en tidiazurón, zeatina, benciladenina, cinetina y dimetilaliladenina, y combinaciones de los mismos.

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, que además comprende la etapa de cocultivar al menos una plántula con al menos una especie microbiana en un medio cuaternario para establecer una asociación entre planta y microorganismo.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende aclimatar la plántula que tiene una asociación consolidada entre planta y microorganismo a unas condiciones fotosintéticas y sin esterilidad.

11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, que además comprende utilizar la plántula y/o planta en la fitorremediación, en los sistemas de fitorreactores o para la producción de biomasa.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la fitorremediación comprende:

consolidar muchas plantas que poseen las mismas características genéticas en un medio líquido o una superficie de terreno; y

poner en contacto las raíces de las plantas con un contaminante medioambiental en el medio líquido o en la superficie de terreno, lo que ocasiona que el contaminante medioambiental sea retirado del medio líquido.

13. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende la etapa de seleccionar al menos un rasgo de interés en el cultivo celular embriogénico totipotente, en el que al menos un rasgo de interés es un resultado de la variación somaclonal del cultivo celular embriogénico o de la introducción

de al menos una secuencia nucleotídica heteróloga en el genoma de una célula del cultivo celular embriogénico; y cultivar el cultivo celular embriogénico totipotente que comprende al menos un rasgo de interés para producir una línea vegetal de élite.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que al menos un rasgo de interés es la resistencia y/o incremento de la tolerancia a una condición medioambiental.