Método para la medida de colesterol en lipoproteína de alta densidad.

Un método para la medida de colesterol en lipoproteína de alta densidad en una muestra,

que comprende:hacer reaccionar la muestra con i) colesterol esterasa y colesterol oxidasa o ii) colesterol esterasa, coenzimaoxidada y colesterol deshidrogenasa en un medio acuoso que comprende; al menos una sustancia seleccionada delgrupo que consiste en sustancia representadas por la fórmula general (I):

en donde R1 representa un grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 10 a 18 átomosde carbono; R2 representa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 30 átomos de carbono ogrupo alquenilo que tiene 2 a 30 átomos de carbono; R3 y R4 representa cada uno un grupo metilo; y X representaun anión, y sustancias representadas por la fórmula general (II):

en donde R5 representa un grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 10 a 18 átomosde carbono; y R6 y R7 representa cada uno un grupo metilo; y un polianión; y medir el peróxido de hidrógenoformado o coenzima reducida.

Método para la medida de colesterol en lipoproteína de alta densidad

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método, un reactivo y un equipo para la medida de colesterol en lipoproteína 5 de alta densidad en una muestra.

Fundamento de la técnica Las lipoproteínas en sistemas vivos se clasifican en lipoproteína de alta densidad (en adelante abreviado como HDL) , lipoproteína de baja densidad (en adelante abreviado como LDL) , lipoproteína de muy baja densidad (en adelante abreviado como VLDL) y quilomicrón (en adelante abreviado como CM) según su gravedad específica. 10 Cada clase de lipoproteína tiene una función considerablemente diferente in vivo principalmente según la clase de apoproteínas y además tiene una composición diferente de lípidos. Se sabe que, de estas lipoproteínas, HDL está implicada en la eliminación de colesterol acumulado en las células porque recibe colesterol a partir de tejidos que incluyen paredes arteriales, y es un factor de prevención de riesgo para diversas clases de arteriosclerosis, por ejemplo, arteriosclerosis coronaria, y por lo tanto, su nivel en sangre es un índice útil para predecir el comienzo de enfermedades arterioscleróticas.

Los métodos convencionales para la medida de colesterol en HDL (en adelante abreviado como HDL colesterol) consisten en dos etapas de operación, es decir, fraccionamiento por el método de ultracentrifugado, el método inmunoquímico, el método de electroforesis, el método de precipitación, etc. y determinación de colesterol. Sin embargo, las operaciones de fraccionamiento son complicados y consumidores de tiempo y además tienen un problema respecto a la seguridad. Por lo tanto, los métodos de medida que contienen estas operaciones de separación son extremadamente ineficaces y no están adaptados para el uso práctico.

En años recientes, se han propuesto diversos métodos de medida para resolver los problemas anteriores. Ejemplos de los métodos incluyen: un método para la determinación fraccional de HDL colesterol que comprende hacer reaccionar suero o plasma con colesterol esterasa y colesterol oxidasa en un tampón que comprende las enzimas 25 anteriores, y sal biliar, un derivado de ácido biliar o dioctilsulfosuccinato, para permitir al colesterol en VLDL y LDL reaccionar con las enzimas antes de la reacción de HDL colesterol, midiendo el peróxido de hidrógeno formado, y añadiendo después un tensioactivo no iónico que tiene un grupo de óxido de polioxietileno a la disolución de reacción para permitir al HDL colesterol reaccionar con las enzimas (véase el documento de patente núm. 1) ; y un método para la medida de HDL colesterol que comprende hacer reaccionar suero con colesterol esterasa derivada 30 del páncreas y colesterol oxidasa en un tampón que comprende las enzimas, un tensioactivo que pertenece al grupo de ácidos biliares y un tensioactivo no iónico a un pH específico y una temperatura específica (véase el documento de patente núm. 2) . En el método descrito en el documento de patente núm. 2, la reacción de LDL colesterol con las enzimas procede primero y después la reacción de HDL colesterol con las enzimas procede, lo que permite la medida de HDL colesterol. Sin embargo, estos métodos requieren mucho tiempo para medir y no siempre son específicos para la medida de HDL colesterol.

Ejemplos conocidos de los métodos para la medida de HDL colesterol agregando lipoproteínas distintas de HDL incluyen: un método que usa un reactivo para agregar lipoproteínas distintas de HDL (por ejemplo, sulfato de dextrano) , una sal de metal divalente y una enzima químicamente modificada (véase el documento de patente núm. 3) ; un método que usa un reactivo que forma un complejo con lipoproteínas distintas de HDL (por ejemplo, polianión) 40 y un tensioactivo que no disuelve lipoproteínas (por ejemplo, copolímero de polioxietileno-polioxipropileno) (véase el documento de patente núm. 4) ; un método que usa un polianión (por ejemplo, sulfato de dextrano) , una sal de metal divalente, un tensioactivo no iónico específico y albúmina que es diferente de la albúmina contenida en una muestra (véase la documento de patente núm. 5) ; y un método para la medida de HDL colesterol en suero o plasma que comprende tratar suero o plasma con una disolución que contiene un agente fraccionador de lipoproteína (una 45 combinación de un polianión tal como sulfato de dextrano y un catión divalente tal como ión magnesio) , hacer reaccionar la mezcla obtenida con colesterol esterasa y colesterol oxidasa en presencia de un tensioactivo aniónico (ácido alquilsulfónico, ácido biliar o su derivado) sin someter la mezcla a separación sólido-líquido, y medir el peróxido de hidrógeno formado (véase la documento de patente núm. 6) .

Estos métodos para la medida de HDL colesterol agregando lipoproteínas distintas de HDL tienen una buena 50 correlación con los métodos estándar convencionales. Sin embargo, hay problemas con estos métodos tales como imprecisión debido a la turbidez provocada por agregados formados mediante la reacción, y una carga excesiva a un autoanalizador debido a la deposición de hidróxido metálico formado por la reacción con sal metálica en una disolución de reacción cuando las células de reacción se lavan con una disolución alcalina.

Ejemplos conocidos de los métodos para la medida de HDL colesterol sin agregar lipoproteínas distintas de HDL

incluyen: un método para la medida de HDL colesterol en una muestra biológica que comprende hacer reaccionar la muestra biológica con colesterol esterasa derivada del páncreas y colesterol oxidasa en presencia de ácido biliar o su sal y albúmina, y medir un compuesto consumido o formado por la reacción enzimática (véase el documento de patente núm. 7) ; y un método para la medida de HDL colesterol en una muestra que comprende hacer reaccionar la

muestra con lipoproteína lipasa que actúa preferentemente en la fracción HDL y/o colesterol esterasa y colesterol oxidasa en presencia de un tensioactivo no iónico con un valor HLB de 16 o más que tiene una selectividad de reacción a la fracción HDL (véase el documento de patente núm. 8) . También se conoce un método en que el colesterol en lipoproteínas distintas de HDL se convierte preferentemente en peróxido de hidrógeno con acilpolioxietilen-sorbitan-éster, y después de que el peróxido de hidrógeno formado se elimine, el HDL colesterol se mide de forma enzimática añadiendo polioxietilen-alquiléter (véase el documento de patente núm. 9) .

Sin embargo, estos métodos para la medida de HDL colesterol sin agregar lipoproteínas distintas de HDL a veces tienen el problema de imprecisión de valores de medida debido a la eliminación incompleta de colesterol en lipoproteínas distintas de HDL y reacción no específica con colesterol en lipoproteínas distintas que HDL.

Ejemplos conocidos adicionales de los métodos para la medida de HDL colesterol sin agregar lipoproteínas distintas de HDL incluyen: un método para la medida de HDL colesterol en una muestra que comprende hacer reaccionar la muestra con i) colesterol esterasa y colesterol oxidasa o ii) colesterol esterasa, coenzima oxidada y colesterol deshidrogenasa en un medio acuoso que comprende un tensioactivo no iónico, un polianión y albúmina, y medir el peróxido de hidrógeno formado o coenzima reducida (véase el documento de patente núm. 10) ; y un método para la medida de HDL colesterol que comprende hacer reaccionar una muestra con colesterol esterasa y colesterol oxidasa, o colesterol esterasa, coenzima oxidada y colesterol deshidrogenasa en un medio acuoso que comprende un derivado de ácido biliar, y medir el peróxido de hidrógeno formado o coenzima reducida (véase el documento de patente núm. 11) .

Documento de patente núm. 1: Solicitud de Patente No Examinada Publicada Japonesa núm. 69999/87 Documento de patente núm. 2: Solicitud de Patente No Examinada Publicada Japonesa núm. 126498/88 Documento de patente núm. 3: Solicitud de Patente No Examinada Publicada Japonesa núm. 131197/96 Documento de patente núm. 4: Solicitud de Patente No Examinada Publicada Japonesa núm. 201393/96 Documento de patente núm. 5: Solicitud de Patente No Examinada Publicada Japonesa núm. 285298/97 Documento de patente núm. 6: Solicitud de Patente No Examinada Publicada Japonesa núm. 116996/96 Documento de patente núm. 7: Panfleto WO97/40376 Documento de patente núm. 8: Panfleto WO00/52480 Documento de patente núm. 9: Solicitud de Patente No Examinada Publicada Japonesa núm. 299/97 Documento de patente núm. 10: Panfleto WO04/035816 Documento de patente núm. 11: Panfleto WO04/035817 Descripción de la Invención Problemas a ser Resueltos por la Invención... [Seguir leyendo]

1. Un método para la medida de colesterol en lipoproteína de alta densidad en una muestra, que comprende:

hacer reaccionar la muestra con i) colesterol esterasa y colesterol oxidasa o ii) colesterol esterasa, coenzima oxidada y colesterol deshidrogenasa en un medio acuoso que comprende; al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en sustancia representadas por la fórmula general (I) :

en donde R1 representa un grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 10 a 18 átomos de carbono; R2 representa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 30 átomos de carbono o grupo alquenilo que tiene 2 a 30 átomos de carbono; R3 y R4 representa cada uno un grupo metilo; y X representa un anión, y sustancias representadas por la fórmula general (II) :

en donde R5 representa un grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 10 a 18 átomos de carbono; y R6 y R7 representa cada uno un grupo metilo; y un polianión; y medir el peróxido de hidrógeno formado o coenzima reducida.

2. El método según la Reivindicación 1, en donde el medio acuoso comprende además al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en albúmina, polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina.

3. El método según la Reivindicación 1 o 2, en donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.

4. Un reactivo para la medida de colesterol en lipoproteína de alta densidad que comprende: al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en sustancias representadas por la fórmula general (I) :

en donde R1 representa un grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 10 a 18 átomos de carbono; R2 representa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 30 átomos de carbono o grupo alquenilo que tiene 2 a 30 átomos de carbono; R3 y R4 representa cada uno un grupo metilo; y X representa un anión, y sustancias representadas por la fórmula general (II) :

en donde R5 representa un grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 10 a 18 átomos de carbono; y R6 y R7 representa cada uno un grupo metilo; un polianión; colesterol esterasa; colesterol oxidasa y un reactivo para la medida de peróxido de hidrógeno.

5. Un reactivo para la medida de colesterol en lipoproteína de alta densidad que comprende: al menos una sustancia 30 seleccionada del grupo que consiste en sustancias representadas por la fórmula general (I) :

en donde R1 representa un grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 10 a 18 átomos de carbono; R2 representa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 30 átomos de carbono o grupo alquenilo que tiene 2 a 30 átomos de carbono; R3 y R4 representa cada uno un grupo metilo; y X representa un anión, y sustancias representadas por la fórmula general (II) :

en donde R5 representa un grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 10 a 18 átomos de carbono; y R6 y R7 representa cada uno un grupo metilo; un polianión; colesterol esterasa; colesterol deshidrogenasa y coenzima oxidada.

6. El reactivo según la Reivindicación 5, que comprende además un reactivo para la medida de coenzima reducida.

7. El reactivo según cualquiera de las Reivindicaciones 4 o 6, que comprende además al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en albúmina, polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina.

8. El reactivo según cualquiera de las Reivindicaciones 4 o 7, en donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.

9. Un equipo para la medida de colesterol en lipoproteína de alta densidad que comprende un primer reactivo y un segundo reactivo, que comprende: al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en sustancias representadas por la fórmula general (I) :

en donde R1 representa un grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 10 a 18 átomos de carbono; R2 representa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 30 átomos de carbono o grupo alquenilo que tiene 2 a 30 átomos de carbono; R3 y R4 representa cada uno un grupo metilo; y X representa un anión, y sustancias representadas por la fórmula general (II) :

en donde R5 representa un grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 10 a 18 átomos de carbono; y R6 y R7 representa cada uno un grupo metilo; y un polianión en el primer reactivo; colesterol oxidasa en el segundo reactivo; un reactivo para la medida de peróxido de hidrógeno en cualquiera o ambos del primer reactivo y el segundo reactivo; y colesterol esterasa en cualquiera o ambos del primer reactivo y el segundo reactivo.

10. Un equipo para la medida de colesterol en lipoproteína de alta densidad que comprende un primer reactivo y un segundo reactivo, que comprende: al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en sustancias 30 representadas por la fórmula general (I) :

en donde R1 representa un grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 10 a 18 átomos de carbono; R2 representa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1 a 30 átomos de carbono o grupo alquenilo que tiene 2 a 30 átomos de carbono; R3 y R4 representa cada uno un grupo metilo; y X representa un anión; y sustancias representadas por la fórmula general (II) :

en donde R5 representa grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 10 a 18 átomos de carbono; y R6 y R7 representa cada uno un grupo metilo; y un polianión en el primer reactivo; colesterol deshidrogenasa en el segundo reactivo; coenzima oxidada en cualquiera o ambos del primer reactivo y el segundo reactivo; y colesterol esterasa en cualquiera o ambos del primer reactivo y el segundo reactivo.

11. El equipo según la Reivindicación 10, que comprende además un reactivo para la medida de coenzima reducida en cualquiera o ambos del primer reactivo y el segundo reactivo.

12. El equipo según cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 11, que comprende además al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en albúmina, polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina en cualquiera o ambos del primer reactivo y el segundo reactivo.

13. El equipo según cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 12, en donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.