METODO Y REACTIVO QUE PERMITE MEDIR EL COLESTEROL EN LA LIPO PROTEINA DE ALTA DENSIDAD.

Un método para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad en una muestra,

que consiste en:

reacción de una muestra con i) colesterol esterasa y colesterol oxidasa o ii) colesterol esterasa, una coenzima oxidada y colesterol deshidrogenasa en un medio acuoso que contiene un surfactante no iónico, polianión y albúmina, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo, y medición del peróxido de hidrógeno formado o una coenzima reducida

Método y reactivo que permite medir el colesterol en la lipoproteína de alta densidad.

La presente invención se relaciona con un método para determinar cuantitativamente el colesterol en la lipoproteína de alta densidad (a continuación, abreviada como HDL) en una muestra, un reactivo para el mismo y un kit para el mismo.

Dependiendo de su densidad, las lipoproteínas en los organismos vivos se clasifican en lipoproteína de alta densidad, lipoproteína de baja densidad (a continuación, abreviada como LDL), lipoproteína de muy baja densidad (a continuación, abreviada como VLDL) y quilomicrón (a continuación, abreviada como QM). Sus funciones en el organismo vivo difieren mucho, dependiendo mayormente de la diferencia en el tipo de apoproteína, y sus composiciones lipídicas también varían. Entre ellas, la HDL se relaciona con la eliminación del colesterol acumulado en las células al recibir el colesterol de diversos tejidos, incluyendo la pared arterial, y es un factor para la prevención del riesgo de varias enfermedades arterioscleróticas, tales como la arteriosclerosis coronaria. Se sabe que el nivel de HDL en la sangre es útil para predecir la aparición de enfermedades arterioscleróticas.

El método convencional para determinar cuantitativamente el colesterol en HDL (a continuación, abreviado como HDL-colesterol) consiste en dos etapas: una etapa de fraccionación por un método de ultracentrifugación, un método inmunoquímico, un método electroforético, un método de precipitación y similares, y una etapa de determinación cuantitativa del colesterol. Sin embargo, la etapa de fraccionación es complicada y su operación lleva mucho tiempo y, más aún, existe un problema en términos de seguridad. Por lo tanto, los métodos de medición que incluyen dicha etapa de fraccionación no son adecuados para el uso práctico, ya que son demasiado ineficientes.

En los últimos años, se han descrito varios métodos de medición para resolver los problemas anteriores. Por ejemplo, se conoce un método consistente en mezclar suero o plasma en un tampón que contiene colesterol esterasa y colesterol oxidasa y una sal de ácido biliar, un derivado de ácido biliar o sulfosuccinato de dioctilo con las enzimas para que reaccione el colesterol de la VLDL y la LDL antes que el HDL-colesterol, medir el peróxido de hidrógeno formado, añadir un surfactante no iónico que tiene un grupo óxido de polioxietileno a la solución de reacción para que el HDL-colesterol reaccione con las enzimas y medir el HDL-colesterol fraccionadamente (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 69999/1987); y un método de medición para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol, consistente en hacer reaccionar suero, en un tampón que contiene colesterol esterasa derivada de páncreas, colesterol oxidasa, un surfactante de tipo ácido biliar y un surfactante no iónico con las enzimas a un pH especifico y una temperatura especifica (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 12 6498/1988). En un método de medición mencionado en el documento de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 126498/1988, a medida que procede primeramente la reacción de LDL colesterol con las enzimas y que procede luego la reacción de HDL-colesterol con las enzimas, se puede realizar la determinación de HDL-colesterol. Sin embargo, esos métodos tardan mucho en ser operados y, más aún, no siempre son específicos para el HDL-colesterol.

Con respecto a un método para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol donde se agregan lipoproteínas distintas de la HDL, se conoce, por ejemplo, un método de medición que utiliza un reactivo que agrega lipoproteínas distintas de la HDL, tal como el sulfato de dextrano, una sal de metal divalente y una enzima químicamente modificada (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 131197/1996); un método de medición que utiliza un reactivo que forma un complejo con lipoproteínas distintas de la HDL, tal como un polianión, y un surfactante que no disuelve la lipoproteína, tal como un copolímero de polioxietileno-polioxipropileno (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 201393/1996); un método de medición que utiliza un polianión, tal como el sulfato de dextrano, una sal de metal divalente, un surfactante no iónico específico y albúmina, que se suplementa a la albúmina contenida en la muestra (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 285298/1997); un método para medir el HDL-colesterol en suero o plasma consistente en tratar el suero o el plasma con una solución que contiene un agente fraccionador de lipoproteínas (una combinación de polianión, tal como el sulfato de dextrano, con un catión divalente, tal como el ion magnesio), sin separar la solución de la mezcla resultante en sólido y líquido, tratar la solución con colesterol esterasa y colesterol oxidasa en presencia de surfactante aniónico (sulfonato de alquilo, ácido biliar o sus derivados) y medir el peróxido de hidrógeno formado (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 116996/1996); un método consistente en añadir una substancia que forma un complejo con lipoproteínas distintas de la HDL, tal como un polianión, y un surfactante específico que no disuelve la lipoproteína a una muestra biológica y medir enzimáticamente el HDL-colesterol (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 201393/1996), y similares.

Aquellos métodos para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol donde se agregan lipoproteínas distintas de la HDL tienen una buena correlación con el método estándar convencional. Sin embargo, existen problemas, tales como la inexactitud debida a la turbidez producida por los agregados formados en la reacción y una excesiva carga en el autoanalizador debido a la deposición de hidróxido metálico producido en las células de reacción por reacción de la sal metálica en la solución de reacción con un álcali usado para lavar las células de reacción.

Con respecto a un método para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol sin agregación de lipoproteínas distintas de la HDL, se conoce, por ejemplo, un método de medición del HDL-colesterol consistente en poner en contacto una muestra biológica con colesterol esterasa derivada del páncreas y colesterol oxidasa en presencia de ácido biliar o de una sal del mismo y de albúmina, y medir el compuesto que se consume o produce por la reacción enzimática del HDL-colesterol (Publicación Internacional WO 97/40376); un método de medición del HDL-colesterol en una muestra consistente en la reacción de una muestra con colesterol esterasa y/o lipoproteína lipasa, que actúan sobre la fracción de HDL preferentemente, y colesterol oxidasa en presencia de un surfactante no iónico que tiene un valor HLB de más de 16, así como una selectividad de reacción para la fracción de HDL (Publicación Internacional WO 00/52840), y similares. Además, se conoce también un método en el que el colesterol en lipoproteínas distintas de la HDL se convierte selectivamente un peróxido de hidrógeno usando éster acilpolioxietilensorbitán, se elimina el peróxido de hidrógeno resultante y se mide enzimáticamente el HDL-colesterol añadiendo polioxietilén alquil éter (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 299/1997).

Sin embargo, en aquellos métodos para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol en los que no se agregan lipoproteínas distintas de la HDL, puede existir un problema de inexactitud de valor medido causada por una incompleta eliminación del colesterol en lipoproteínas distintas de la HDL o por una reacción no específica con el colesterol en lipoproteínas distintas de la HDL.

Además, cuando se mide una substancia específica en una muestra por un medio óptico, es un grave problema que la turbidez causada por la proteína insoluble en agua dé un efecto óptico a la determinación en el caso de muestras que derivan de pacientes que sufren de proteinemia M, mieloma y similares. Para evitar el efecto óptico, se conoce comúnmente un método que resuelve que resuelve la turbidez causada por la proteína insoluble en agua ajustando la sal en la solución de reacción a una alta concentración. Sin embargo, en la determinación cuantitativa del HDL-colesterol, existen algunos casos en que la presencia de sal a una elevada concentración puede inducir un descenso en la especificidad. Por lo tanto, la determinación cuantitativa del HDL-colesterol en presencia de una sal a alta concentración es con frecuencia muy difícil.

WO-A-02/40707 se relaciona con un método de estudio de un lípido en donde se estudia el lípido...

1. Un método para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad en una muestra, que consiste en:

2. El método según la reivindicación 1, donde el medio acuoso contiene además un derivado de ácido biliar.

3. El método según la reivindicación 2, donde el derivado de ácido biliar es un derivado aniónico de ácido biliar.

4. Un reactivo para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que consiste en un surfactante no iónico, polianión, albúmina, colesterol esterasa, colesterol oxidasa y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina, y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.

5. Un reactivo para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que consiste en un surfactante no iónico, polianión, albúmina, colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa y una coenzima oxidada, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.

6. El reactivo según la reivindicación 5, que además incluye un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.

7. El reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que además incluye un derivado de ácido biliar.

8. El reactivo según la reivindicación 7, donde el derivado de ácido biliar es un derivado aniónico de ácido biliar.

9. Un kit para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que consiste en un primer reactivo y un segundo reactivo, donde se incluyen colesterol esterasa, polianión, un surfactante no iónico, albúmina y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo y se incluye colesterol oxidasa en el segundo reactivo, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.

10. Un kit para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que consiste en un primer reactivo y un segundo reactivo, donde se incluyen colesterol esterasa, polianión, un surfactante no iónico, albúmina y una coenzima oxidada en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo y se incluye colesterol deshidrogenasa en el segundo reactivo, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.

11. El kit según la reivindicación 10, que además incluye un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo.

12. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que además incluye un derivado de ácido biliar en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo.

13. El kit según la reivindicación 12, donde el derivado de ácido biliar es un derivado aniónico de ácido biliar.