MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE NEOANGIOGÉNESIS TUMORAL.

Método para la detección de neoangiogénesis tumoral.

La presente invención se refiere a un método para la detección de neoangiogénesis tumoral.

La presente invención también se refiere a un inmunoensayo para la detección de neoangiogénesis tumoral; así como a un kit para la detección de la neoangiogénesis tumoral y a la utilización del nivel de monocitos CD14+ circulantes, el nivel de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ circulantes y el porcentaje de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ circulantes que expresan el antígeno ACE/BB9 (CD143) en una muestra de sangre aislada como biomarcador para la detección de la neoangiogénesis tumoral. En particular dicha neoangiogénesis tumoral está asociada con CRC.

Método para la detección de neoangiogénesis tumoral.

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la detección de la neoangiogénesis tumoral, en particular asociada con el cáncer colorrectal.

Antecedentes La neoangiogénesis es necesaria para el crecimiento de tumores sólidos. Son muchas las evidencias que indican que, además del crecimiento por brotes, la angiogénesis tumoral está sustentada por la movilización y la incorporación de células progenitoras derivadas de la médula ósea. El estudio de las células progenitoras endoteliales (EPCs) ha generado un considerable interés y controversia ya que la contribución de las EPCs a la vasculatura tumoral varía considerablemente entre modelos de ratón y tipo de tumor. De este modo, se ha descrito una contribución significativa, aunque variable, de las EPCs a la vasculatura tumoral, variando desde aproximadamente un 90% en linfomas (1) a un 10% en el sarcoma de Ewing (2) . Sin embargo, en otros modelos, las EPCs no contribuían al crecimiento tumoral (3) , sólo se requerían en la fase tardía de los tumores (4) o inducían la angiogénesis indirectamente (57) . También se ha investigado la implicación de las EPCs en la vascularización tumoral humana. De este modo, mediante hibridación in situ por fluorescencia con sondas específicas para los cromosomas sexuales, se observó que la contribución de las EPCs al endotelio tumoral variaba desde aproximadamente un 1% hasta un 12% (8) . Por otro lado, se ha descrito que en ciertos cánceres los niveles de las EPCs están elevados (9) e incluso se han propuesto como biomarcadores de valor pronóstico y para evaluar los efectos de la terapia antiangiogénica (10-13) .

Recientemente, se ha dirigido una mayor atención a las células hematopoyéticas derivadas de la médula ósea reclutadas al microentorno tumoral por factores angiogénicos. Estas células permanecen próximas a los nuevos vasos sanguíneos, contribuyendo al proceso angiogénico (14) . Además, los macrófagos asociados al tumor están infiltrados en los tumores (15, 16) y en ratones, los monocitos que expresan Tie-2 se sitúan en los tumores, donde son requeridos para la angiogénesis (17, 18) . Adicionalmente, se ha descrito que el reclutamiento de las células hematopoyéticas es necesario y suficiente para restaurar la angiogénesis tumoral (1, 19) . Aunque la evidencia sustancial indica que la angiogénesis tumoral está sustentada por las células hematopoyéticas, existen pocos reportes en la literatura que apoyen el papel de estas células en tumores sólidos humanos.

El cáncer colorectal (CRC) , que incluye el cáncer de colon y el cáncer de recto, es responsable de medio millón de muertes anuales en el mundo. Existen aproximadamente un millón de nuevos casos diagnosticados anualmente, convirtiéndolo en el tercer cáncer más común en el mundo. La detección temprana, el diagnóstico preciso y la vigilancia intensiva son importantes para mejorar más el pronóstico del paciente y la respuesta a la terapia.

Existen una serie de métodos que los doctores utilizan para detectar el CRC que incluyen, la sigmoidoscopia, la colonoscopia y el enema de bario. Algunas técnicas mas recientes que se están investigando para la detección eficaz y el seguimiento del paciente con CRC son la colonografía CT (colonografía tomográfica computerizada) y los biomarcadores moleculares.

Los marcadores tumorales se utilizan durante el tratamiento del cáncer a efectos de hacer un seguimiento de la eficacia de una terapia y de evaluar cómo el paciente puede estar respondiendo al tratamiento. Si disminuyen los niveles de un biomarcador tumoral, puede significar que el cáncer está respondiendo al tratamiento. Si los niveles permanecen igual o aumentan después del tratamiento puede ser una indicación de que la terapia no está funcionando. La monitorización continuada de los niveles de los biomarcadores tumorales después del tratamiento se puede utilizar para comprobar la reaparición del cáncer.

En la detección temprana o screening de pacientes de CRC, se utilizan ampliamente los marcadores en heces. Se han estudiado marcadores en tejidos como posibles marcadores de pronóstico o predictivos de la enfermedad, mientras que los biomarcadores de CRC en suero (sangre) se utilizan principalmente para la vigilancia postoperativa de pacientes.

Marcadores tisulares Los marcadores tisulares se han investigado como posibles marcadores de pronóstico y predictivos de respuesta a un tratamiento. De entre los genes candidatos como biomarcadores en CRC cabe destacar el gen de la timidilato sintasa, el p53 y el proto-oncogen K-ras, entre otros. La timidilato sintasa (TS) es una enzima clave en la biosíntesis de pirimidinas, esencial para la síntesis de ADN. La actividad de la enzima TS es inhibida por el 5-fluorouracilo (5-FU) y se ha estudiado como un marcador predictivo de respuesta a la quimioterapia con 5-FU y 5-fluorodesoxiuridina (para una revisión adicional sobre TS, véase Popat S, Matakidou A, Houlston RS. J Clin Oncol 2004; 22:529-536; Lecomte T, Ferraz JM, Zinzindohoué F et al. Clin Cancer Res 2004;10:5880-5888; Shirota Y, Stoehlmacher J, Brabender J et al. J Clin Oncol 2001; 19:4298-4304) . El gen p53 codifica para un factor de transcripción que se une a las secuencias reguladoras de un número de genes diana para iniciar la programación de la parada del ciclo celular y reparación del ADN. La pérdida de función de p53 es crítica en la tumorigénesis, siendo frecuentes las alteraciones en este gen en el CRC (para una revisión adicional sobre p53, véase Tejpar S, Bertagnolli M, Bosman F et al. The Oncologist 2010;15:390-404; Braun MS, Richman SD, Quirke P et al. J Clin Oncol 2008; 26:2690-2698) .

El proto-oncogén K-ras se asocia a menudo con el cáncer, ya que se han hallado alteraciones en este gen en muchos tumores. Las vías de señalización mediadas por K-ras regulan la proliferación celular. Las mutaciones de K-ras están relacionadas con aproximadamente la mitad de todos los CRCs y se ha observado que son importantes en las etapas iniciales de la enfermedad. Ciertos estudios han identificado una asociación entre las mutaciones de K-ras y una mala evolución de la enfermedad en pacientes con CRC. Para más detalles sobre mutaciones de K-ras, véase Lièvre A, Bachet JB, Le Corre D et al. Cancer Res 2006; 66:3992-3995; Karapetis CS, Khambata-Ford S, Jonker DJ et al. N Engl J Med 2008; 359:1757-1765.

Marcadores en heces La prueba de sangre oculta en heces (FOBT) es la prueba de screening más utilizada habitualmente para el CRC. Existen dos tipos principales de FOBT, la prueba con guaiac y la prueba inmunoquímica. Ambas pruebas detectan proteínas que pueden ser indicadoras de CRC.

Las ventajas de la FOBT para el CRC son que las pruebas son simples y asequibles, no invasivas, requieren muy poca preparación del paciente y tienen la capacidad de examinar todo el tracto colorrectal. Sin embargo, presentan una especificidad y sensibilidad relativamente bajas tanto para los adenomas precancerosos como para el CRC.

Las pruebas de ADN fecal se utilizan en el screening de CRC y se basan en que el ADN es excretado por las células desprendidas de las lesiones cancerosas. Las pruebas utilizan normalmente un panel de marcadores de ADN con el fin de identificar genes mutados. Los marcadores de ADN pueden proporcionar una prueba más precisa que la FOBT y no existen restricciones en la dieta o la medicación. Sin embargo, la prueba es bastante laboriosa, cara y carece de especificidad. Algunos ejemplos de marcadores de ADN en heces incluyen K-ras, APC (adenomatous polyposis coli ó poliposis adenomatosa coli) y p53.

Marcadores séricos Los marcadores séricos para el CRC se utilizan principalmente para el seguimiento de los pacientes después de la extirpación quirúrgica de tumores malignos. A los pacientes se les hace un seguimiento regular después de la intervención quirúrgica con el fin de detectar cualquier recidiva o metástasis. Como hasta un 50% de los pacientes desarrollan una enfermedad recurrente o metástasis después de la intervención quirúrgica, éste es un aspecto importante en el tratamiento del CRC. El CEA (antígeno carcinoembrionario) fue el primer marcador en suero utilizado en pacientes con CRC y aunque es el más antiguo, aún sigue siendo el más ampliamente utilizado. El CEA se utiliza principalmente para el seguimiento de los pacientes después de la intervención quirúrgica de un CRC primario. Una serie de estudios han demostrado que un seguimiento intensivo después de la resección del cáncer está asociado con una... [Seguir leyendo]

1. Método para la detección de neoangiogénesis tumoral que comprende las etapas de:

a) Proporcionar una muestra de sangre aislada de un individuo;

b) Obtener células nucleadas de la muestra de sangre aislada;

c) Determinar el nivel de monocitos CD14+ circulantes, el nivel de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ circulantes y el porcentaje de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ circulantes que expresan el antígeno ACE/BB9 (CD143) en las células nucleadas de la muestra de sangre aislada;

d) Comparar la proporción entre el nivel de monocitos CD14+ circulantes dividido por el nivel de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ circulantes con respecto al porcentaje de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ circulantes que expresan el antígeno ACE/BB9 (CD143) determinados en c) con los valores obtenidos para individuos control o individuos sanos.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha determinación se lleva a cabo mediante citometría de flujo.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha neoangiogénesis tumoral está asociada con cáncer colorrectal.

4. Inmunoensayo que se utiliza en la etapa c) del método de detección de neoangiogénesis tumoral en una muestra de sangre aislada de un individuo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

a) Unir un anticuerpo monoclonal anti-CD45 humano al antígeno de las células hematopoyéticas CD45+ circulantes;

b) Unir por lo menos un anticuerpo monoclonal anti-humano al antígeno de los monocitos CD14+ circulantes, al antígeno de las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ circulantes y al antígeno de las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ circulantes que expresan el antígeno ACE/BB9 (CD143) ;

c) Mezclar en un recipiente reactivos y células;

d) Detectar dicha unión entre anticuerpos y antígenos mediante por lo menos un reactivo.

5. Inmunoensayo según la reivindicación 4, en el que dicho por lo menos un anticuerpo monoclonal antihumano se selecciona del grupo de anticuerpos monoclonales anti-humano que consiste en anti-CD34, anti-CD14, y anti-ACE/CD143 (BB9) .

6. Inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que dicho reactivo para la detección se selecciona del grupo que consiste en isotiocianato de fluoresceína (FITC) , ficoeritrina (PE) , peridin clorofila (PerCP) , PE-cianina 7 (PE-Cy7) , aloficocianina (APC) , APC-cianina 7 (APC-Cy7) y APC-H7.

7. Inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que dicha neoangiogénesis tumoral está asociada con cáncer colorrectal.

8. Kit para la detección de neoangiogénesis tumoral, que comprende:

a) por lo menos un medio de recepción para recibir una muestra de sangre aislada del individuo, preferiblemente tubos que contienen citrato y Ficoll;

b) un anticuerpo seleccionado entre anti-CD45 humano, anti-CD34 humano, anti-CD14 humano y anti-ACE/CD143 (BB9) humano;

c) un reactivo de detección seleccionado del grupo que consiste en isotiocianato de fluoresceína (FITC) , ficoeritrina (PE) , peridin clorofila (PerCP) , PE-cianina 7 (PE-Cy7) , aloficocianina (APC) , APC-cianina 7 (APC-Cy7) y APC-H7;

d) isotipos para el control;

e) instrucciones para la utilización del kit.

9. Kit según la reivindicación 8, en el que dicha neoangiogénesis tumoral está asociada con cáncer colorrectal.

10. Utilización del nivel de monocitos CD14+ circulantes, el nivel de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ circulantes y el porcentaje de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ circulantes que expresan el antígeno ACE/BB9 (CD143) en una muestra de sangre aislada como biomarcador para la detección de neoangiogénesis tumoral.

11. Utilización según la reivindicación 10, en el que dicha neoangiogénesis tumoral está asociada con cáncer colorrectal.

FIGURA 1 FIGURA 2 FIGURA 3 FIGURA 4 FIGURA 5