MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE UN AGENTE CON ACTIVIDADES DE MODULACIÓN ANGIOGÉNICA USANDO UN EMBRIÓN DE TELEÓSTEO.

Método para la detección de un agente con actividades de modulación angiogénica usando un embrión de teleósteo Campo antecedente de la invención La angiogénesis es un proceso fisiológico de formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos existentes (Risau, 1997). Este proceso sólo se da normalmente en el crecimiento y el desarrollo, y la curación de heridas restableciendo el flujo sanguíneo en los tejidos. Sin embargo, la pérdida del control en la angiogénesis es un factor en las enfermedades más importantes tales como cáncer y artritis reumatoide (Liekens y col., 2001). Estas enfermedades pueden ser resultado de u obtenerse de la progresión cuando los nuevos vasos sanguíneos crecen de manera excesiva o insuficiente. Por ejemplo, la angiogénesis excesiva se da en el cáncer por la producción anormal de una cantidad excesiva de los factores de crecimiento angiogénicos para formar nuevos vasos sanguíneos para una demanda excesiva de nutriente. Por otra parte, se produce una angiogénesis insuficiente, por ejemplo, en una enfermedad de las arterias coronarias, causando la lesión y muerte tisular debido a una producción inadecuada del factor de crecimiento angiogénico para un crecimiento suficiente de vasos sanguíneos. Por lo tanto, la terapia tiene por objeto tratar la pérdida del control en la angiogénesis que se persigue activamente por las compañías farmacéuticas de todo el mundo. Conocimiento antecedente y descripción de la técnica anterior Incluso aunque existe un enorme mercado potencial para los productos terapéuticos relacionados con la angiogénesis, es difícil encontrar un ensayo adecuado para evaluar el efecto de la respuesta de la angiogénesis (Staton y col., 2004). Los ensayos más usados ampliamente son ensayos in vitro en los que se prueban nuevos fármacos en células endoteliales cultivadas en matraces de plástico. El inconveniente es que es difícil extrapolar la observación hecha en un ensayo in vitro para modelar el complejo proceso de la angiogénesis que se da realmente en situaciones in vivo (Staton y col., 2004; Taraboletti y Giavazzi, 2004). Por otra parte, los ensayos in vivo usando modelos de animales, por ejemplo, ratones, son costosos, consumen mucho tiempo y son difíciles de cuantificar (Staton y col., 2004). Por lo tanto, comúnmente se emplean múltiples ensayos in vitro para la identificación de compuestos candidatos y la eficacia de los compuestos candidatos sobre la angiogénesis se validará posteriormente mediante más de un ensayo in vivo. Sin embargo, la cuantificación todavía es un parámetro clave importante para los ensayos de angiogénesis. Los criterios para un ensayo de la angiogénesis cuantitativa ideal (Hasan y col., 2004) son que el ensayo debe: 1) proporcionar una medición cuantitativa de la estructura de vasos sanguíneos recién formados; 2) proporcionar una medición cuantitativa de caracteres funcionales de vasos sanguíneos recién formados; 3) poder distinguir los vasos sanguíneos recién formados y los que existen previamente; 4) permitir un estudio a largo plazo; 5) ser rentable, rápido, fácil de usar, reproducible; y 6) no causar ningún daño tisular. Hasta ahora, ninguno de los ensayos in vivo existentes cumplía realmente estos requisitos (Hasan y col., 2004; Taraboletti y Giavazzi, 2004). Parece que un ensayo de detección de fármacos in vivo usando pez cebra como modelo cumple los criterios de un ensayo de angiogénesis cuantitativo ideal. El ensayo in vivo de pez cebra tiene las ventajas y comodidades de los ensayos in vitro (alto rendimiento en comparación con los ensayos in vitro) y los ensayos in vivo (siendo un organismo intacto), y por lo tanto podrá servir como puente o filtro entre la detección in vitro y la validación in vivo posterior (Epstein y Epstein, 2005; Goldsmith, 2004; Parng y col., 2002). El ensayo in vivo del pez cebra eliminará los componentes candidatos, debido a los efectos tóxicos, de la lista identificada a partir de los ensayos in vitro antes de introducir una fase más costosa de la validación in vivo. Se ha demostrado que el ensayo in vivo del pez cebra es un método útil para detectar fármacos angiogénicos (revisado por (Kidd y Weinstein, 2003)). Por ejemplo, Serbedzija y sus colaboradores describieron una metodología de detección que se baso en el recuento numérico de vasos sanguíneos subintestinales formados sobre la superficie del saco vitelino sobre ambos lados del embrión (Serbedzija y col., 1999). Los vasos sanguíneos se tiñeron para obtener la actividad de la fosfatasa alcalina endógena. Se han desarrollado líneas de pez cebra transgénicas con vasos sanguíneos fluorescentes (Cross y col., 2003; Lawson y Weinstein, 2002) de tal forma que la representación por imágenes y el análisis de la angiogénesis puede simplificarse en gran medida. Sin embargo, todavía no existe una metodología que describa completamente los procedimientos y herramientas sobre cómo usar el pez cebra como una herramienta cuantitativa para el descubrimiento de un fármaco angiogénico junto con la prueba de toxicidad correspondiente. El documento WO 99/42606 describe sistemas de ensayo de detección biológica en los que se usan teleósteos para 2   la detección de la actividad de modulación angiogénica y la actividad tóxica de un agente en sistemas de ensayo paralelos. Sumario de la invención Esta invención se refiere a un método biológico de detección como se define en las reivindicaciones adjuntas. El presente sistema de detección de tres niveles cumple los criterios de un ensayo de angiogénesis cuantitativo enumerado anteriormente y proporciona un sistema de ensayo de detección eficaz para identificar el agente de modulación de la angiogénesis con menos toxicidad. El modelo preferido de la presente invención son embriones de pez cebra o de medaka. La ventaja de la presente invención es que puede identificar rápidamente los agentes de modulación angiogénicos potenciales en el primer nivel y estos agentes de modulación angiogénicos potenciales después se someten a las pruebas se seguridad de los niveles 2 y 3, respectivamente. Por lo tanto, los candidatos finales de los agentes candidatos que pasen los 3 niveles tendrán la actividad angiogénica deseable con la menor toxicidad. En el primer nivel, el objeto es identificar rápidamente cualquier agente capaz de inducir la alteración en el patrón vascular en un teleósteo. En este nivel, los embriones se tratan con el agente en un amplio intervalo de concentración, cubriendo 7 ordenes de magnitud. Para visualizar los vasos sanguíneos en los embriones transparentes, se aplica tinción con color para detectar la actividad de la fosfatasa alcalina endógena predominantemente en las células endoteliales vasculares. Se selecciona un patrón de vasos intersegmentarios como la diana que se va a examinar ya que el patrón es regular y la variación entre los individuos es muy pequeña, haciendo que la interpretación del efecto angiogénico sea mucho más fácil. La fase preferida de los embriones que se van a examinar es de al menos 72 horas post-fertilización (hpf). Cualquier alteración en el patrón de los vasos intersegmentarios en cualquier concentración del agente concluirá como el agente de modulación angiogénica y el agente pasará al siguiente nivel. En el segundo nivel, se determinará la relación de dosis respuesta del agente. La relación de dosis respuesta describe el cambio en los efectos, es decir, muerte y malformación causados por niveles diferentes de concentraciones del agente. El estudio de la relación de dosis respuesta es fundamental para determinar los niveles seguros y peligrosos del agente en estudio. La relación de dosis respuesta se representa en forma de una gráfica, denominada curva de dosis respuesta. El primer punto a lo largo de la curva en el que se alcanza una respuesta, es decir, efectos totales incluidos muerte y malformación, por encima de 0 se denomina como la concentración umbral, o concentración sin efectos adversos observados (NOAEC). Por encima de la concentración umbral, todavía aparecerán efectos adversos indeseables, es decir, muerte y malformación, y el efecto será mucho más fuerte según aumente la concentración. Por lo tanto, en este nivel, se determina la NOAEC del agente en un teleósteo. La fase preferida de los embriones que se van a examinar es de 24 o 48 hpf. En el tercer nivel, se determina si el agente en el nivel de NOAEC, en lugar de anormalidades graves, inducirá algún efecto adverso a nivel de los órganos y a nivel celular. Por lo tanto, se evaluará la seguridad de un agente por medio de una prueba de citotoxicidad, prueba de toxicidad en órganos y una prueba de cardiotoxicidad. Además, se ensayará la actividad de modulación angiogénica en la NOAEC. En este nivel, la visualización de vasos intersegmentarios... [Seguir leyendo]

1. Un método biológico de detección de un agente para la actividad de modulación angiogénica, que comprende un sistema de ensayo de detección biológica de 3 niveles jerárquicos: a. un primer nivel en el que se usan embriones de teleósteos para detectar un agente que tiene actividades de modulación angiogénica; b. un segundo nivel en el que se determina la "concentración sin efecto adverso observado (NOAEC)" del agente en embriones de teleósteos a partir de una relación dosis-respuesta que describe el cambio en los efectos de anormalidades graves que incluyen la muerte y la malformación causadas por diferentes niveles de concentraciones del agente; c. un tercer nivel en el que se determina si el agente en la NOAEC inducirá algún efecto adverso a nivel de órgano y a nivel celular de los embriones de teleósteos, así como la tenencia de actividades de modulación angiogénica. 2. El método de la reivindicación 1, en el que el embrión de teleósteo es un embrión de pez cebra o de medaka. 3. El método de la reivindicación 2, en el que los embriones de pez cebra o de medaka se tratan con un agente a concentraciones que incluyen 7 órdenes de magnitud en el primer nivel. 4. El método de la reivindicación 2, en el que el primer momento y el último momento para añadir el agente al medio es 4 horas post-fertilización y 20 horas post-fertilización, respectivamente. 5. El método de la reivindicación 2, en el que el primer nivel comprende una etapa para la visualización y el análisis del patrón del sistema vascular en el pez cebra o en el medaka. 6. El método de la reivindicación 5, en el que el pez cebra o el medaka se examina entre 3 a 5 días después de la fertilización, y el patrón del sistema vascular se visualiza mediante la tinción de las células endoteliales con sustratos de colores o sustratos fluorescentes en peces cebra o medakas fijados, o inyectando sustratos fluorescentes en el sistema circulatorio en peces cebra o medakas vivos. 7. El método de la reivindicación 5, en el que la táctica de análisis se realiza contando el número de vasos sanguíneos intersegmentarios, bien totalmente desde la cabeza hasta la cola o bien en una región particular. 8. El método de la reivindicación 2, en el que el segundo nivel comprende una etapa para determinar la NOAEC del agente sobre el pez cebra o el medaka a diferentes concentraciones durante al menos un tiempo de exposición de 1 día. 9. El método de la reivindicación 2, en el que el tercer nivel comprende una etapa para medir el tamaño y la forma de los órganos diana. 10. El método de la reivindicación 9, en el que el órgano se visualiza mediante sustratos específicos de los órganos. 11. El método de la reivindicación 10, en el que los sustratos específicos de los órganos son sustratos fluorescentes. 12. El método de la reivindicación 2, en el que la aparición de células muertas se determina en al menos 100 peces cebra o medakas por concentración en el tercer nivel. 13. El método de la reivindicación 2, en el que el tercer nivel comprende una etapa para determinar la cardiotoxicidad de los agentes. 14. El método de la reivindicación 13, en el que el pez cebra o el medaka es de al menos 48 horas post-fertilización. 15. El método de la reivindicación 13, en el que los parámetros que se han a medir son la frecuencia cardiaca y la ritmicidad de los latidos del corazón. 9