Un método para detectar células epiteliales diseminadas viables en una muestra que comprende células procedentes de un paciente normalmente no asociadas con células epiteliales,

comprendiendo el método:

cultivar las células en dicha muestra durante un tiempo suficiente para que un marcador específico para la célula epitelial sea liberado a partir de las células, comprendiendo el marcador una citoqueratina esencialmente de longitud completa;

detectar el marcador liberado;

en el que la detección del marcador indica la presencia de células epiteliales diseminadas.

Método para la detección de células epiteliales cancerosas utilizando citoqueratinas liberadas como marcadores para dichas células

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la detección y caracterización de células derivadas de tejidos epiteliales, incluidos tumores epiteliales.

ANTECEDENTES

Células epiteliales presentes en órganos mesenquimales (p. ej. sangre, médula ósea o nódulos linfáticos) se pueden detectar mediante la expresión y/o liberación de proteínas del citoesqueleto específicas para el epitelio, denominadas citoqueratinas. Por ejemplo, células de tumores epiteliales derivadas de carcinomas tales como cánceres de mama, próstata, pulmón o colon se pueden detectar en el nivel de célula simple utilizando citoqueratinas (Pantel K, Brakenhoff RH, 2004, Nat Rev Cancer 4:448-56; Alix-PanabiÃres C. et al., 2007, Clin Chem 53:537-9) .

Las citoqueratinas constituyen el subgrupo de proteínas de los filamentos intermedios más amplio, y representan una familia multigen con más de 20 tipos diferentes de polipéptidos que se dividen en queratinas de tipo I de carácter relativamente ácido (CK9-CK20) y de tipo II de carácter básico (CK1-CK8) (Moll R, et al., 1982, Cell, 31:1124) . Células de epitelio normal expresan al menos una queratina de tipo I y una de tipo II. Las citoqueratinas forman el citoesqueleto de células epiteliales, y su función principal consiste en mantener la integridad de las células epiteliales. La expresión de citoqueratinas varía con el tipo de células epiteliales y, habitualmente, se mantiene en células de tumores epiteliales (p. ej., cáncer de mama, colon, próstata, etc.) (Steinert et al., 1988, Annu Rev Biochem 57:593-625; Chu et al., 2002, Histopathology 40:403-39) , a pesar de que pueden producirse cambios en el modelo de expresión de proteínas individuales del citoesqueleto en células de carcinoma de mama humano (Willipinski et al., 2005, Clin Cancer Res 11:8006-8014) . Las citoqueratinas extracelulares se detectan en forma de fragmentos de proteínas sencillos, parcialmente degradados, en forma de pequeños complejos o en forma de grandes complejos proteínicos poliméricos (Rydlander et al., 1996, Eur J Biochem 241:309-14) . Se han sugerido múltiples mecanismos que incluyen una mitosis anormal, el desbordamiento de polipéptidos de citoqueratina monoméricos procedentes de células en división, la degradación proteolítica de citoqueratina en células apoptóticas y/o la neovascularización. Además, fragmentos de citoqueratinas extra-celulares se pueden encontrar circulando en la sangre debido a la infección.

CK19, una de las tres queratinas principales con CK8 y CK18, se encuentra en el epitelio simple o estratificado y en carcinomas, y se ha demostrado que se expresa de forma estable y abundante en tumores epiteliales primarios tales como de mama, colon, pulmón y células cancerígenas hepatocelulares, pero no en células hematopoyéticas mesenquimales. Varios estudios han demostrado que, tras el estrés de la célula inducido por la apoptosis, citoqueratinas tipo I se convierten en sustratos para las proteasas caspasa 3 y, específicamente, la proteolisis de CK19 de longitud completa por parte de caspasa 3 para producir el fragmento soluble de CK19, CYFRA 21-1, que se libera en el sobrenadante de células cultivadas y en el suero de pacientes de cáncer de pulmón. (Fuchs et al., 1994, Annu Rev Bochem 63:345-82; Coulombe, PA, 1993, Curr Opin Cell Biol 5:17-29; Ku NO et al., 1997, J Biol Chem 272:33197-203; Dohmoto et al., 2001, Int J Cancer 91:468-373; Sheard et al., 2002, J Cell Biochem 85:670677) . Además de ello, Ding et al., (2004, Mol Cell Proteomics 3:73-81) demostraron que la sobre-expresión de CK19 intracelular en carcinoma hepatocelular está relacionada con el comportamiento metastásico. Sin embargo, no se ha informado sobre la liberación de la proteína CK19 de longitud completa (intacta) .

La medición de CYFRA 21-1 en la circulación ha sido establecida para vigilar a pacientes con cánceres de pulmón y en cánceres de cabeza y cuello (Bodenmuller et al., 1994, Int J Biol Markers 9:75-81; Nisman et al., 1988, Cancer 82:1850-9; Pujol et al., 1993, Cancer Res 53:61-6) . CK19 intracelular también se ha utilizado como un marcador para la detección de células cancerígenas micrometastásicas en la médula ósea, los nódulos linfáticos y la sangre periférica mediante inmunocitoquímica (ICC - siglas en inglés) y RT-PCR (Braun et al., 2000, N Engl J Med 2000, 342:525-533; Schoenfeld et al., 1997, Eur J Cancer 33:854-861) . Matouskova et al., 2000, Breast Cancer Research and Treatment 60 (3) : 241-249 describe el cultivo de células epiteliales procedentes de muestras de tejido de mama y señala que las células de carcinomas invasivos son, en la mayoría de los casos, positivas para queratina 19, que en el epitelio mamario normal es una característica de la célula luminal totalmente diferenciada. Sin embargo, estos métodos no son capaces de distinguir entre células viables y apoptóticas, y no son adecuados para detectar proteínas marcadoras secretadas.

Existe la necesidad de un método para detectar células epiteliales viables que liberen una citoqueratina de longitud completa. También se necesita un método para detectar una citoqueratina liberada, de longitud completa, en calidad de un marcador de células epiteliales diseminadas presentes en una muestra no epitelial para indicar la presencia de células tumorales.

BREVE SUMARIO

En un aspecto de la presente invención se ha desarrollado un método para detectar células epiteliales diseminadas viables en una muestra que comprende células procedentes de un paciente, que normalmente no están asociadas a células epiteliales. El método incluye cultivar las células en la muestra durante un tiempo suficiente para que un marcador específico para la célula epitelial sea liberado de las células en los casos en los que el marcador sea una citoqueratina esencialmente de longitud completa. El método incluye, además, detectar el marcador liberado. La detección del marcador indica la presencia de células epiteliales diseminadas.

En otro aspecto de la presente invención, el método para detectar células epiteliales diseminadas viables en una muestra que comprende células procedentes de un paciente, no asociadas normalmente con células epiteliales, incluye, además, cultivar las células durante un tiempo suficiente para que el marcador epitelial sea liberado de las células, en el que el marcador es un polipéptido esencialmente de longitud completa que tiene un sitio de escisión enzimática dentro del polipéptido de longitud completa. El método incluye, además, detectar una porción del polipéptido de longitud completa, encontrándose la porción en posición 5' con respecto al sitio de escisión enzimática. La detección de la porción 5' identifica al polipéptido de longitud completa, en donde la porción 5'

comprende una secuencia de polipéptidos esencialmente idéntica a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 15.

Ventajas de la presente invención resultarán más evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción de las realizaciones preferidas de la presente invención que han sido mostradas y descritas a modo de ilustración. Como se reconocerá, la invención es susceptible de otras y diferentes realizaciones, y sus detalles son susceptibles de modificación en diversos aspectos. Por consiguiente, los dibujos y la descripción han de considerarse como ilustrativos por naturaleza y no como restrictivos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Se describirán ahora a modo de ejemplo realizaciones de la presente invención con referencia a los dibujos que se acompañan, en los que:

La FIG. 1 es un diagrama esquemático de CK19 que ilustra los sitios de unión de los anticuerpos anti- citoqueratina y el sitio de escisión de caspasa 3:

La FIG. 2 A es la secuencia de aminoácidos de CK19 de longitud completa (SEQ ID NO: 1) que muestra el péptido tríptico único que distingue a CK19 de longitud completa de CYFRA 21-1 subrayada (SEQ ID NO: 2) ; y La FIG. 2B, el espectro MS/MS del péptido específico para CK19 ([M+2H]2+; m/z 1007, 86) , que muestra la serie de iones y de este péptido con la secuencia parcial inversa ‘ASDVEVSVQ' (SEQ ID NO: 15) que demuestra que CK19 de longitud completa fue detectada en el sobrenadante exento de células de células MCF-7; y La FIG. 3 ilustra análisis de Kaplan-Meier realizados con pacientes de cáncer de mama investigados durante una media... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar células epiteliales diseminadas viables en una muestra que comprende células procedentes de un paciente normalmente no asociadas con células epiteliales, comprendiendo el método:

cultivar las células en dicha muestra durante un tiempo suficiente para que un marcador específico para la célula epitelial sea liberado a partir de las células, comprendiendo el marcador una citoqueratina esencialmente de longitud completa; detectar el marcador liberado; en el que la detección del marcador indica la presencia de células epiteliales diseminadas.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra se deriva de sangre, médula ósea o nódulos linfáticos.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra está desprovista de células CD-45+.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el marcador comprende una citoqueratina 19 esencialmente de longitud completa.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el marcador comprende una secuencia que es al menos 90% idéntica a un polipéptido de longitud completa de SEQ. ID. NO: 1.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la detección del marcador liberado comprende unir el marcador liberado con un participante en la unión.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el participante en la unión comprende un anticuerpo.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el anticuerpo reconoce un epítopo en el marcador 5' con respecto al sitio de escisión enzimática en el marcador.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la detección del marcador liberado comprende utilizar espectrometría de masas.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la secuencia del marcador liberado detectado mediante espectrometría de masas comprende una secuencia de polipéptidos esencialmente idéntica a SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 8, SEQ. ID. NO: 9, SEQ. ID. NO: 10 o SEQ. ID. NO: 15.

11. El método de la reivindicación 1, comprendiendo el método:

cultivar las células durante un tiempo suficiente para que el marcador epitelial sea liberado a partir de las células, comprendiendo el marcador un polipéptido esencialmente de longitud completa que contiene un sitio de escisión enzimática dentro del polipéptido de citoqueratina de longitud completa;

detectar una porción del polipéptido de longitud completa a partir liberado de las células, encontrándose la porción en posición 5' con respecto al sitio de escisión enzimática;

en el que la detección de la porción 5' identifica al polipéptido de longitud completa, y en el que la porción 5' comprende una secuencia de polipéptidos esencialmente idéntica a SEQ.

ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 8, SEQ. ID. NO: 9, SEQ. ID. NO: 10 o SEQ. ID. NO: 15.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la porción 5' se detecta utilizando un anticuerpo o utilizando espectrometría de masas.

13. El método de la reivindicación 11, en el que el polipéptido esencialmente de longitud completa comprende citoqueratina 19.

14. El método de la reivindicación 11, en el que la identificación del marcador de longitud completa en una muestra normalmente no asociada con células epiteliales indica la presencia de una célula de un tumor epitelial diseminado.

15. El método de la reivindicación 1, en el que las células se aíslan a partir de tejido de mama.