Método para el diagnóstico mejorado de las displasias.

Método para discriminar las células displásicas que sobreexpresan productos génicos INK4a de otrascélulas que expresan productos génicos INK4a a un nivel detectable en muestras biológicas,

seleccionado de entreun grupo que consiste de:

a. un método que comprende determinar en un procedimiento de ensayo citológico o histológico lacoexpresión de por lo menos dos moléculas marcadoras en por lo menos una célula individual, en elque por lo menos una molécula marcadora es un producto de expresión codificado por el gen INK4a ypor lo menos una molécula marcadora adicional es un marcador de proliferación celular para laproliferación celular activa, en el que la sobreexpresión de por lo menos un producto génico INK4a y laexpresión de por lo menos un marcador para la proliferación celular activa a un nivel detectable dentrode dicha célula individual es indicativa del estado displásico de la célula, y

b.. un método que comprende determinar en un procedimiento de ensayo citológico o histológico lacoexpresión de por lo menos dos moléculas marcadoras en por lo menos una célula individual, en elque por lo menos una molécula marcadora es un producto de expresión codificado por el gen INK4a ypor lo menos una molécula marcadora adicional es un marcador de proliferación característico de laproliferación celular retardada o detenida, en el que la sobreexpresión de por lo menos un producto delgen INK4a y la expresión de por lo menos un marcador característico de la proliferación celularretardada o detenida a un nivel detectable dentro de dicha célula individual es indicativa del estado nodisplásico de la célula.

Método para el diagnóstico mejorado de las displasias

La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico mejorado de las displasias que se basa en la detección simultánea de los productos del gen INK4a y en por lo menos un marcador de la proliferación celular. Particularmente, la presente invención proporciona un método para discriminar las células displásicas que sobreexpresan productos del gen INK4a de las células que sobreexpresan productos del gen INK4a pero que no son displásicas, mediante la detección de un marcador adecuado para la caracterización de las propiedades de proliferación de la célula respectiva. La caracterización de las propiedades de proliferación puede comprender la detección de un marcador o conjunto de marcadores característico de la proliferación celular activa, y/o un marcador

o conjunto de marcadores característico de la proliferación celular retardada o detenida. De esta manera, el método presentado en la presente memoria permite un diagnóstico específico de las displasias en los especímenes histológicos y citológicos.

La detección de la sobreexpresión de p16INK4a en las muestras biológicas ha demostrado ser un marcador útil en la detección de las lesiones anogenitales, tales como el carcinoma del cérvix uterino (ver la patente WO nº 00/01845; Klaes et al., Int. J. Cancer 92:276-2784, 2001) . El método basado en la tinción inmunoquímica específica de p16INK4a permite una identificación sensible y específica de las células displásicas en secciones de tejidos y en muestras citológicas.

En los exámenes inmunohistoquímicos de los tejidos displásicos, las células neoplásicas pueden teñirse utilizando un procedimiento de tinción mediado por un anticuerpo específico de p16INK4a. De esta manera, puede corroborarse el diagnóstico histológico de las lesiones neoplásicas con un procedimiento de tinción basado en un marcador molecular característico de la transformación de las células en las lesiones anogenitales. El diagnóstico en estos procedimientos, sean o no neoplásicas las células, se basa en la tinción específica de p16INK4a, aunque también se basa en información histológica.

Lo anterior se debe al hecho de que en aproximadamente 20% a 30% de las muestras, las células metaplásicas muestran cierta inmunorreactividad con los anticuerpos específicos de p16INK4a y de esta manera resultan teñidas durante el curso de los procedimiento. Sin embargo, el patrón de tinción proporcionado por dichas células metaplásicas difiere del patrón ofrecido por las lesiones neoplásicas. Las células metaplásicas dan lugar un patrón de tinción irregular o focalizado, mientras que las lesiones neoplásicas dan lugar a un patrón de tinción difusa. Además, las intensidades de la tinción de las células metaplásicas son mayoritariamente inferiores a las de las células neoplásicas.

Los métodos habituales utilizados en los ensayos de cribado para la detección precoz de las displasias y/o neoplasias no utilizan ensayos basados en la histología sino que más bien se basan en procedimientos de ensayo citológico. Sin embargo, especialmente en los casos en los que no se dispone de información histológica sobre la arquitectura de los tejidos, tales como, por ejemplo, en los exámenes citológicos, el ensayo para la sobreexpresión de p16INK4a por sí solo puede conducir a resultados falsos positivos. Esto se debe al hecho de que aquellas fracciones de células metaplásicas que expresan p16INK4a a niveles detectablemente elevados podrían no diferenciarse según los criterios histológicos.

El porcentaje de células que muestran una sobreexpresión de p16INK4a se incrementa durante el curso de la aparición de las displasias. De esta manera, durante las etapas neoplásicas o preneoplásicas, en el caso de que únicamente se encuentre presente una población restringida de células neoplásicas o preneoplásicas en las

p16INK4a

muestras, la inmunorreactividad de puede ser débil. Esta débil inmunorreactividad puede ser de aproximadamente del nivel provocado por las células metaplásicas. En etapas posteriores de las displasias, la inmunorreactividad global de p16INK4a es más fuerte y por lo tanto las lesiones neoplásicas son fácilmente discernibles de las metaplasias, incluso en un formato de ensayo citológico. Esto podría conducir a casos en los que la presencia de células metaplásicas que expresan p16INK4a se confunda con la presencia de células neoplásicas y de esta manera genere un resultado falso positivo.

Especialmente en los ensayos de cribado, en los que la detección de etapas tempranas de las neoplasias resulta deseable, esta condición resulta bastante indeseable. Ello resulta especialmente cierto porque el diagnóstico basado en p16INK4a ha demostrado ser una herramienta valiosa en los exámenes histológicos y la aplicación en un procedimiento de cribado basado en la citología podría mejorar dichos procedimientos establecidos.

Para reducir los resultados falsos positivos en los formatos de ensayo citológico y de esta manera incrementar adicionalmente la fidelidad del diagnóstico mediado por p16INK4a de las lesiones anogenitales, resultaría deseable un método para discriminar las metaplasias de las lesiones neoplásicas y displásicas. Un método para la discriminación de las metaplasias de las lesiones neoplásicas y preneoplásicas se proporciona en las realizaciones reivindicadas según la presente invención.

Para proporcionar soporte a la discriminación de las lesiones metaplásicas de las neoplásicas en los procedimientos de ensayo basados en la sobreexpresión de p16INK4a resultaría deseable una molécula marcadora que se expresase en células y tejidos neoplásicos y/o preneoplásicos y que no se expresase simultáneamente con productos génicos INK4a en una misma célula metaplásica.

Una solución al problema existente en la técnica se proporciona en los métodos reivindicados según la presente invención. Durante el curso de los experimentos que han conducido a la presente invención, los inventores han encontrado que una combinación de detección de la presencia o ausencia y/o del nivel de p16INK4a y por lo menos un marcador para la proliferación celular tal como, por ejemplo, Ki67, Ki-S2, mcm5 ó mcm2, podría resolver el problema existente en la técnica.

En la técnica se presenta un par de documentos referentes a la utilización de una combinación de marcadores moleculares para el diagnóstico mejorado de las displasias. En la patente WO nº 0208764 se da a conocer un método para el diagnóstico mejorado de los tumores malignos cervicales utilizando una combinación de un marcador de VPH y un marcador para la proliferación celular o la actividad vírica. Se menciona p16INK4a en el contexto de la presente invención como marcador de la actividad vírica para la combinación con marcadores de VPH.

En la patente EP nº 1217377 se da a conocer un método para la detección automática de tumores malignos cervicales mediada por la detección de más de una molécula marcadora. Se indican algunas combinaciones definidas de marcadores en dicho documento. No se proporciona enseñanza en dicho documento referente a la elección de marcadores adecuados para una combinación. El propósito de la combinación en la presente solicitud es una fidelidad mejorada del análisis automatizado de los patrones de tinción en especímenes citológicos biológicos. Dicho documento menciona la combinación de p16INK4a con otros marcadores tumorales.

La patente WO nº 2059616 da a conocer un método para la detección de alteraciones del ciclo celular para el diagnóstico mejorado de los tumores malignos cervicales. El documento da a conocer que las células displásicas muestran alteraciones en el control del ciclo celular y que de esta manera podrían identificarse mediante la detección de las proteínas de tipo ciclina E conjuntamente con sustancias posteriores a la etapa G1 en las células.

Jeffrey Keating en "Ki67, Cyclin E, and p16INK4a Are Complimentar y Surrogate Biomarkers for human papilloma Virus-Related Cervical Neoplasia" (American Journal of Surgical Pathology 25 (7) :884-891, 2001) da a conocer la complementariedad de la utilización de p16INK4a, Ki67 y ciclina E en el curso del diagnóstico de las displasias cervicales. El documento se refiere a los problemas de cada marcador individual en la detección de las displasias y los estados, a que p16INK4a en combinación con la ciclina E podría resultar adecuado... [Seguir leyendo]

1. Método para discriminar las células displásicas que sobreexpresan productos génicos INK4a de otras células que expresan productos génicos INK4a a un nivel detectable en muestras biológicas, seleccionado de entre un grupo que consiste de:

a. un método que comprende determinar en un procedimiento de ensayo citológico o histológico la coexpresión de por lo menos dos moléculas marcadoras en por lo menos una célula individual, en el que por lo menos una molécula marcadora es un producto de expresión codificado por el gen INK4a y por lo menos una molécula marcadora adicional es un marcador de proliferación celular para la proliferación celular activa, en el que la sobreexpresión de por lo menos un producto génico INK4a y la expresión de por lo menos un marcador para la proliferación celular activa a un nivel detectable dentro de dicha célula individual es indicativa del estado displásico de la célula, y

b.. un método que comprende determinar en un procedimiento de ensayo citológico o histológico la coexpresión de por lo menos dos moléculas marcadoras en por lo menos una célula individual, en el que por lo menos una molécula marcadora es un producto de expresión codificado por el gen INK4a y por lo menos una molécula marcadora adicional es un marcador de proliferación característico de la proliferación celular retardada o detenida, en el que la sobreexpresión de por lo menos un producto del gen INK4a y la expresión de por lo menos un marcador característico de la proliferación celular retardada o detenida a un nivel detectable dentro de dicha célula individual es indicativa del estado no displásico de la célula.

2. Método según la reivindicación 1, en el que se detecta un conjunto de dos o más marcadores de proliferación celular.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que por lo menos un producto génico INK4a presenta un peso molecular de entre 13 y 19 kDa.

4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que por lo menos un producto génico INK4a se selecciona de entre un grupo que comprende p16INK4a y p14ARF.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el marcador de proliferación celular para la proliferación celular activa se selecciona de entre un grupo que comprende un marcador de proliferación necesario para el mantenimiento de la proliferación celular, un marcador de proliferación participante en la replicación del ADN y un marcador de proliferación que es o que codifica un miembro de la horquilla de replicación procesiva.

6. Método según la reivindicación 5, en el que el producto génico necesario para el mantenimiento de la proliferación celular es una molécula seleccionada de entre el grupo que comprende moléculas de Ki67, moléculas de Ki-S5 y moléculas de Ki-S2.

7. Método según la reivindicación 6, en el que el producto génico participante en la replicación del ADN se selecciona de entre un grupo que comprende helicasas o subunidades de las mismas, moléculas del ciclo de división celular (cdc) , moléculas de fosfatasa y moléculas de quinasa.

8. Método según la reivindicación 7, en el que las helicasas o subunidades de las mismas se seleccionan de entre un grupo que comprende MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7 y HELAD1.

9. Método según la reivindicación 7, en el que las moléculas de cdc, las quinasas y las fosfatasas se seleccionan de entre un grupo que comprende proteínas quinasa CDC6 y CDC7, Dbf4, proteína fosfatasa CDC14, CDC45 y MCM10.

10. Método según la reivindicación 5, en el que las moléculas participantes en la horquilla de replicación procesiva se seleccionan de entre un grupo que comprende PCNA y POLD.

11. Método según la reivindicación 1, en el que el marcador característico para la proliferación celular retarda o detenida se selecciona de entre un grupo que comprende un marcador de senescencia, un marcador de detención del ciclo celular, un marcador de apoptosis, p21, p27, caspasas, BAD, CD95, ligando Fas y proteínas Parp.

12. Método según las reivindicaciones 1 a 11, en el que el producto génico es un polipéptido o una molécula de ácidos nucleicos.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que además se detecta por lo menos una molécula marcadora adicional para la mejora de la evaluación del diagnóstico o pronóstico.

14. Método según la reivindicación 13, en el que la molécula marcadora adicional se selecciona de entre un grupo que comprende un marcador de senescencia, un marcador de apoptosis, un marcador de detención del ciclo celular, un marcador de diferenciación terminal de las células, un marcador de infección vírica, un marcador de actividad vírica, una proteína reguladora del ciclo celular, un producto génico necesario para el mantenimiento de la proliferación celular, un producto génico participante en la replicación del ADN y un producto génico que es un miembro de la horquilla de replicación procesiva.

15. Método según la reivindicación 14, en el que el marcador de infección vírica es un marcador de infección por VPH de alto riesgo seleccionado de entre un grupo que comprende VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH39, VPH45, VPH51, VPH52, VPH56, VPH58, VPH59, VPH66 y VPH68.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se aplica adicionalmente un procedimiento de tinción citológica utilizando por lo menos un pigmento seleccionado de entre un grupo que comprende DAPI, quinacrina, cromomicina, azán, naranja de acridina, hematoxilina, eosina, rojo Sudán, azul de toludina y tionina, o un método de tinción seleccionado de entre el grupo que comprende la tinción Pap, la tinción Giemsa, la tinción de hematoxilina-eosina, la tinción de van-Gieson, la tinción de Schiff, la tinción con precipitados metálicos, la tinción de azul de Turnbull y la tinción con cianuros metálicos.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células displásicas son células de una lesión cancerosa o precancerosa.

18. Método según la reivindicación 17, en el que la lesión se selecciona de entre un grupo que comprende una lesión del tracto anogenital, una lesión del tracto respiratorio y una lesión de la piel y sus apéndices.

19. Método según la reivindicación 18, en el que la lesión se selecciona de entre un grupo que comprende una lesión del cérvix uterino, una lesión de la vagina, una lesión de la vulva, una lesión del pene, una lesión del ano, una lesión del recto, una lesión del árbol bronquial, una lesión de pulmón, una lesión del espacio peritoneal, una lesión del espacio nasofaríngeo, una lesión de la cavidad oral o una lesión de la piel.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra biológica es una muestra que contiene células, particularmente una preparación citológica o histológica originada en el tracto anogenital, del tracto respiratorio o de la piel y sus apéndices.

21. Método según la reivindicación 20, en el que las células son células originadas en el cérvix uterino, la vagina, la vulva, el pene, el ano, el recto, el árbol bronquial, el pulmón, el espacio nasofaríngeo, la cavidad oral o la piel.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la detección de los productos génicos INK4a y/o las moléculas marcadoras de proliferación celular se lleva a cabo utilizando por lo menos una sonda que reconoce específicamente por lo menos una de las moléculas respectivas que debe detectarse.

23. Método según la reivindicación 22, en el que se marca detectablemente por lo menos una sonda.

24. Método según la reivindicación 23, en el que por lo menos un marcaje se selecciona de entre el grupo que consiste de un isótopo radioactivo, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato metálico, un enzima, biotina o digoxigenina.

25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que por lo menos una sonda es una proteína y/o un ácido nucleico.

26. Método según la reivindicación 25, en el que por lo menos una sonda es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido contra un producto génico codificado por INK4a o un producto génico marcador de proliferación celular.

27. Método según la reivindicación 26, que comprende un procedimiento de tinción inmunocitoquímico.

28. Método según la reivindicación 23 ó 24, en el que por lo menos una sonda es un ácido nucleico que se hibrida específicamente con un producto génico INK4a o un producto génico marcador de proliferación celular.

29. Método según la reivindicación 28, que comprende una reacción de detección seleccionada de entre un grupo que comprende: a) una reacción de hibridación in situ, y b) una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, particularmente una reacción de amplificación por PCR, NAS-BA o LCR.

30. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las reacciones de detección utilizando sondas de ácidos nucleicos y sondas de polipéptidos se llevan a cabo simultáneamente.

31. Kit para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un kit diagnóstico o un kit de investigación, que comprende por lo menos una o más sondas para la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de sobreexpresión de por lo menos un producto génico INK4a y por lo menos un producto génico marcador de proliferación celular en muestras biológicas, en el que los componentes del kit facilitan la detección simultánea de por lo menos un producto génico INK4a y por lo menos un producto génico marcador de proliferación celular en una célula individual presente en las muestras biológicas, y en el que se generan por lo menos dos señales detectables distinguibles, siendo indicativa por lo menos una señal detectable, del nivel de expresión de por lo menos un producto génico INK4a y siendo indicativa por lo menos otra señal detectable, del nivel de expresión de por lo menos un gen marcador de proliferación celular, y en el que las sondas son: a) uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpo dirigidos contra polipéptidos codificados por INK4a, o fragmentos de los mismos, y uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpo dirigidos contra polipéptidos codificados marcadores de proliferación celular, o fragmentos de los mismos, o b) uno o más ácidos nucleicos que se hibridan específicamente con productos génicos INK4a y uno o más ácidos nucleicos que se hibridan específicamente con productos génicos marcadores de proliferación celular.

32. Kit según la reivindicación 31, en el que los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo dirigidos contra los polipéptidos codificados por INK4a o fragmentos de los mismos portan un marcaje detectable que es diferente y distinguible del marcaje detectable que portan los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos contra los productos génicos marcadores de proliferación.

33. Kit según la reivindicación 31, en el que las sondas de ácidos nucleicos que se hibridan específicamente con los productos génicos INK4a portan un marcaje detectable que es diferente y distinguible del marcaje detectable que portan las sondas de ácidos nucleicos que se hibridan específicamente con los productos génicos marcadores de proliferación.

34. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que los productos génicos INK4a se seleccionan de entre el grupo que comprende p16INK4a y p14ARF.

35. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, en el que los productos génicos marcadores de proliferación celular se seleccionan de entre un grupo que comprende CDC6, MCM3, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, proteína quinasa CDC7, Dbf4, proteína fosfatasa CDC14, CDC45 y MCM10, Ki67, Ki-S2, PCNA o POLD.

36. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, que comprende además por lo menos uno de los siguientes:

a. una muestra de p16INK4a para llevar a cabo una reacción de control positivo,

b. una muestra de p14ARF para llevar a cabo una reacción de control positivo,

c. una muestra de Ki67 para llevar a cabo una reacción de control positivo,

d. una muestra de Ki-S2 para llevar a cabo una reacción de control positivo,

e. una muestra de MCM5 para llevar a cabo una reacción de control positivo,

f. una muestra de MCM2 para llevar a cabo una reacción de control positivo,

g. una muestra de PCNA para llevar a cabo una reacción de control positivo,

h. reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o del nivel de p16INK4a,

i. reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o del nivel de p14ARF,

j. reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o del nivel de Ki67,

k. reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o del nivel de Ki-S2,

l. reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o del nivel de MCM5,

m. reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o del nivel de MCM2,

n. reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o del nivel de PCNA,

o. una o más muestras de productos génicos INK4a para llevar a cabo reacciones de control positivo,

p. una o más muestras de productos génicos marcadores de proliferación celular para llevar a cabo reacciones de control positivo,

q. una o más reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o del nivel de otros productos génicos INK4a,

r. y uno o más reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o del nivel de otros productos génicos marcadores de proliferación celular.