Método DIVA de identificación de animales vacunados contra la brucelosis.

Se describen cepas de Brucella modificadas en su antígeno O, de forma que producen un nuevo epítopo inmunogénico, distinto a los producidos por las cepas de Brucella silvestres y que permite diferenciar, por consiguiente, a los animales vacunados de los infectados sin vacunar.

Método DIVA de diferenciación de animales vacunados frente a la brucelosis

OBJETO DE LA INVENCION

La invención se adscribe al campo técnico de la sanidad animal, en concreto a la diferenciación entre animales infectados por una bacteria del género Brucella de los animales vacunados frente a dicha bacteria.

ESTADO DE LA TECNICA

La brucelosis es una zoonosis endémica en gran parte del mundo. Afecta a la sanidad y la producción animal, tiene una importante repercusión en el comercio internacional de animales, así como de los productos derivados de los mismos (entre otros: leche, quesos, derivados lácteos, etc.) y es la causa de la brucelosis humana. La enfermedad humana es rara vez mortal, pero es invalidante, de larga duración y puede dejar secuelas permanentes. Su tratamiento es costoso, pues precisa de la combinación de antibióticos durante periodos prolongados, con riesgo de recaídas. La brucelosis es producida por las bacterias del género Brucella, que incluye varias especies. De entre ellas, las llamadas especies lisas (o S "smooth") infectan a animales domésticos como rumiantes y suidos, además de mamíferos salvajes. Estas especies lisas llevan en su superficie un antígeno característico, ellipopolisacárido (LPS) de tipo liso (S-LPS) , portador de un po lis ac árido O (también llamado antígeno O ó cadena O) . Algunos mutantes de estas especies lisas pueden perder el polisacárido O en la superficie (mutantes rugosos) y, sin embargo, ser capaces de sintetizar precursores del polisacárido O que permanecen en el interior de la bacteria.

No hay vacunas para uso humano, y el control de la brucelosis se basa en la vacunación animal, con la subsiguiente identificación de los animales infectados y la eliminación de éstos. La única evidencia segura de la infección por Brucella es el aislamiento en cultivo, pero dada su dificultad técnica, costo y riesgos, las pruebas serológicas son la herramienta diagnóstica más común. La vacunación animal es el pilar más importante en el control y la erradicación de la enfermedad. Sin embargo, las vacunas animales existentes son portadoras de un LPS de tipo liso y estimulan una respuesta inmune frente a la cadena O muy semejante a la de la infección. Este problema es muy importante, ya que dificulta o hace imposible distinguir los animales vacunados de los infectados cuando, por ejemplo, se produce un brote epidémico, pues el diagnóstico está basado en la detección de anticuerpos frente a la cadena O del LPS de tipo liso.

Las únicas vacunas frente a la brucelosis empleadas con éxito en animales son vacunas vivas atenuadas. La dos vacunas clásicas de referencia, B. abortus S19 en ganado vacuno y B. melitensis Rev1 en ganado ovino y caprino, han demostrado su eficacia tanto en experimentos controlados como en el uso en el campo. Sin embargo conservan la cadena O del LPS, que es el antígeno inmuno-dominante en las pruebas serológicas. Por lo tanto, su uso interfiere en el diagnóstico y dificulta la diferenciación entre animales vacunados e infectados.

Hasta el momento, se han empleado varias estrategias de uso de estas vacunas para minimizar, que no eliminar totalmente, la problemática de diferenciar entre animales vacunados y animales infectados (Nicoletti P, Vaccination. Animal Brucellosis. CRC Press, Boca Raton, 1990;283-299; Blasco 1M, Prev Vet Med 1997:31:275-283) , como son:

1) acotar la vacunación a animales jóvenes

2) emplear dosis vacunales reducidas en adultos.

3) utilizar la vía conjuntival como ruta para la vacunación, en vez de

la subcutánea.

Estas estrategias están basadas en la observación de que (1) , los animales que no han alcanzado la madurez sexual producen una respuesta de anticuerpos frente a al LPS de Brucella de más corta duración que los adultos; (2) , la menor carga antigénica existente en una dosis reducida; y (3) , el que la vía conjuntival distribuye la vacuna directamente a los ganglios linfáticos peri-exofágicos y, de esta forma, las brucelas alcanzan más rápidamente las células diana (ce lulas dendríticas del nódulo linfático) . Aunque estas estrategias reducen la intensidad y duración de los anticuerpos frente a la cadena O del LPS, no resuelven completamente el problema y, además, son inaplicables en la mayoría de los países, o en áreas geográficas de cría extensiva, pues requieren sistemas de marcaje y control de los animales y servicios veterinarios muy eficientes y costosos.

También se han investigado pruebas diagnósticas que, aunque utilizan como antígeno el S-LPS, el polisacárido O o el hapteno nativo (NH) , son sensibles a la cantidad y afinidad de los anticuerpos, habitualmente mayores en la infección que en la vacunación. Sin embargo, ninguna de las soluciones técnicas anteriormente mencionadas permite diferenciar animales vacunados de animales infectados con sensibilidad y especificad del 100% en todos las estrategias de vacunación, particularmente en la vacunación de adultos (W091/06633, Nielsen K, Vet Microbiol 2002;90:447-459; Moriyón, 1., et al., Vet Res 2004;35:1-38) .

Finalmente, se han investigado modificaciones de las vacunas para anular este problema. Una de ellas son las vacunas mutantes rugosas, desprovistas del polisacárido O unido al resto del LPS en la superficie de la bacteria, pero éstas no son suficientemente efectivas (W093/16728; Moriyón, 1., et al., Vet Res 2004;35:138; González D, et al., PLoS.One 2008;3:e2760.2008; Barrio, MB., et al., Vaccine 2009;27: 1741-1749) .

Otra posibilidad es el uso de proteínas recombinantes, vacunas subcelulares o basadas en DNA y/o vectores vacunales, pero éstas inducen una protección menor a la proporcionada por las vacunas vivas atenuadas.

La última aproximación propuesta ha sido la incorporación de la proteína verde fluorescente (GFP) mediante un plásmido de expresión en Brucella a la cepa vacunal S19 (Chacón-Díaz C. et al., Vaccine 2011;29 (3) :577-582) . La cepa S19-GFP mantiene las mismas propiedades biológicas que la de referencia en el modelo murino y los anticuerpos generados frente a esta proteína permiten la discriminación de los ratones inmunizados con S 19-GFP, que presentan fluorescencia, de los infectados con S19, que no la presentarían. No obstante, la experiencia enseña que, en la brucelosis, la respuesta anti-proteínas es de una duración más corta que la respuesta frente a la cadena O del LPS. Por lo tanto, aunque falta experimentación con S 19-GFP en los huéspedes naturales (vacas, en este caso) , la evidencia existente indica que la respuesta frente a GFP será transitoria comparada con la respuesta frente a la cadena O del LPS. Esto es una clara desventaja, ya que una respuesta frente a solamente la cadena O del LPS no permite diferenciar los animales infectados de los vacunados, y así el problema queda sin solución. La cadena O de las brucelas lisas lleva los epítopos inmuno-dominantes que confieren a las correspondientes pruebas serológicas la mejor sensibilidad, pero es también la causa de la interferencia de la vacunación con vacunas lisas en el diagnóstico de la brucelosis.

La cadena O es un polisacárido, en concreto en Brucella es un homopolímero de perosamina (4-amino-4, 6-dideoxi-D-manosa) , sustituida por grupos formilo en posición N y que juega un papel esencial en su estructura antigénica (Bundle, DR. et al., Infect Immun 1989;57:2829-2836) .

La presente invención subyace en manipular el antígeno O para generar cepas marcadas que se diferencien antigénicamente de las cepas virulentas silvestres, pues se ha comprobado ahora que se genera al menos un epítopo característicos de las cepas marcadas, útil para diferenciar los anticuerpos dirigidos contra la vacuna (cadena O modificada) , de los dirigidos contra las cepas virulentas (cadena O original) y, por tanto, los animales vacunados de los infectados. Para alterar la estructura de la cadena O de Brucella se han incorporado en los residuos de perosamina sustituyentes distintos del grupo formilo.

DESCRIPCION DE LA FIGURAS

Figura 1. Demostración de la modificación de la perosamina y aparición de la N-acetilperosamina en la cadena O del LPS de BAB-acet. Análisis por lH_ NMR del O-PS de B.abortus (A) y de BAB-acet (B) . Entorno a 1 lH/ppm se observa

la señal correspondiente a grupo metilo, entorno a 2 lH/ppm la correspondiente a grupo acetilo, entorno a 4 lH/ppm la correspondiente a perosamina y entorno a 8 1H/ppm la correspondiente a grupo formilo.

Figura... [Seguir leyendo]

l. Una bacteria gram-negativa del género Brucella que comprende un antígeno O de un LPS, o de un NH, o de un precursor biosintético de los mismos, o de un fragmento de cualquiera de los anteriores, caracterizada porque al menos uno de los residuos N-formilperosamina de dicho antígeno O ha sido modificado mediante la sustitución del grupo formilo en posición 4-amino de la perosamina, por:

a) un grupo acilo, distinto del grupo formilo, o por b) un azúcar, seleccionado del grupo que comprende hexosas y pentosas.

2. Una bacteria gram-negativa según la reivindicación 1, donde el grupo acilo se selecciona del grupo comprendido por: un grupo acetilo, un grupo 3-deoxi-Lglicerotetronilo, un grupo 3-hidroxipropionilo, un grupo S (+) 2-hidroxipropionilo y un grupo R (-) 2-hidroxipropionilo; preferentemente el grupo acilo es un grupo acetilo.

3. Una bacteria gram-negativa según la reivindicación 2, donde al menos el 20%, preferentemente al menos el 40% y más preferentemente al menos el 60% de los residuos N-formilperosamina del antígeno O han sido sustituidos por residuos de N-acilperosamina distintos de la N-formilperosamina; preferentemente han sido sustituidos por N-acetilperosaminas.

4. Una bacteria gram-negativa según las reivindicaciones 1-3, que comprende, además, un gen heterólogo que codifica: a) una N-aciltransferasa capaz de transferir un grupo acilo, distinto del grupo formilo, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno O; o

b) una N-glicosiltransferasa capaz de transferir un azúcar, seleccionado del grupo que comprende hexosas y pentosas, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno o.

5. Una bacteria gram-negativa según la reivindicación 4, donde la Naciltransferasa es capaz de transferir un grupo acilo seleccionado del grupo comprendido por: un grupo acetilo, un grupo 3-deoxi-L-glicerotetronilo, un grupo 3

hidroxipropionilo, un grupo S (+) 2-hidroxipropionilo, y un grupo R (-) 2

hidroxipropionilo; preferentemente la N-aciltransferasa es una N-acetiltransferasa.

6. Una bacteria gram-negativa según la reivindicación 5, donde la Nacetiltransferasa es una N-acetiltransferasa de Escherichia coli 0157:H7,

7. Una bacteria gram-negativa según las reivindicaciones I a 6, donde dicha bacteria es una Brucella melitensis Rev-I, Brucella abortus S 19, o el mutante de Brucella BABf'1wadB.

8. Un producto que comprende, una molécula que, a su vez, comprende el antígeno O del LPS, o de un NH, o de un precursor biosintético de los mismos, o de un fragmento de cualquiera de los anteriores, caracterizado porque:

a) proviene de una bacteria gram-negativa con un antígeno O comprende un homopolímero de N-formilperosamina; y donde en al menos uno de los residuos Nformilperosamina del antígeno O, el grupo formilo en posición 4-amino de la perosamina ha sido sustituido por:

i) un grupo acilo, distinto del grupo formilo; donde el grupo acilo se selecciona preferentemente del grupo que comprende un grupo acetilo, un grupo 3-deoxi-L-glicerotetronilo, un grupo 3-hidroxipropionilo, un grupo S ( + ) 2-hidroxipropionilo, un grupo R ( -) 2-hidroxipropionilo; más preferentemente el grupo acilo es un grupo acetilo; o por

ii) un azúcar, seleccionado del grupo que comprende hexosas y pentosas; o b) proviene de una bacteria gram-negativa con un antígeno O que comprende

un heteropolímero formado por residuos seleccionados entre: i) N-formilperosamina y N-acilperosamina donde esta N-acilperosamina es distinta de la N-formilperosamina, o ii) N-formilperosamina y N-glicosilperosamina;

preferentemente el heteropolímero está formado por residuos seleccionados entre:

N -formilperosamina y N -acetilperosamina, N-formilperosamina y 3-deoxi-L-glicerotetronilperosamina, N-formilperosamina y 3-hidroxipropionilperosamina, N-formilperosamina y S (+) 2-hidroxipropionilperosamina, o también N-formilperosamina y R ( -) 2-hidroxipropionilperosamina;

más preferentemente el heteropolímero está formado por residuos Nformilperosamina y N-acetilperosamina.

9. Un producto que consiste en una molécula que comprende el antígeno O del LPS, o de un NH, o de un precursor biosintético de los mismos, o de un fragmento de cualquiera de los anteriores, caracterizado porque:

a) proviene de una bacteria gram-negativa con un antígeno O que comprende un homopolímero de N-formilperosamina; y donde en al menos uno de los residuos N-formilperosamina del antígeno O, el grupo formilo en posición 4-amino de la perosamina ha sido sustituido por:

i) un grupo acilo, distinto del grupo formilo; donde el grupo acilo se selecciona preferentemente del grupo que comprende un grupo acetilo, un grupo 3-deoxi-L-glicerotetronilo, un grupo 3-hidroxipropionilo, un grupo S ( + ) 2-hidroxipropionilo, un grupo R ( -) 2-hidroxipropionilo; más preferentemente el grupo acilo es un grupo acetilo; o por

ii) un azúcar, seleccionado del grupo que comprende hexosas y pentosas; o b) proviene de una bacteria gram-negativa con un antígeno O que comprende

un heteropolímero formado por residuos seleccionados entre: i) N-formilperosamina y N-acilperosamina, donde esta Nacilperosamina es distinta de la N-formilperosamina, o ii) N-formilperosamina y N-glicosilperosamina;

preferentemente el heteropolímero está formado por residuos seleccionados entre: N -formilperosamina y N -acetilperosamina, N -formilperosamina y 3-deoxi-L-glicerotetronilperosamina, N-formilperosamina y 3-hidroxipropionilperosamina,

N-formilperosamina y S (+) 2-hidroxipropionilperosamina, o también

N-formilperosamina y R ( -) 2-hidroxipropionilperosamina; más preferentemente el heteropolímero está formado por residuos Nformilperosamina y N-acetilperosamina.

10. Un producto según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, donde la molécula que comprende el antígeno O proviene de una bacteria gram-negativa del género Brucella según las reivindicaciones I a 7.

11. Un producto según las reivindicaciones 8 a lO, donde la molécula que comprende el antígeno O proviene de una bacteria modificada genéticamente, a la que se ha introducido un gen heterólogo que codifica:

a) una N-aciltransferasa capaz de transferir un grupo acilo, distinto del grupo formilo, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno O; preferentemente un grupo acilo seleccionado del grupo comprendido por: un grupo acetilo, un grupo 3-deoxi-L-glicerotetronilo, un grupo 3-hidroxipropionilo, un grupo S (+) 2-hidroxipropionilo, y un grupo R ( -) 2-hidroxipropionilo; más preferentemente la N-aciltransferasa es una N-acetiltransferasa; o

b) una N-glicosiltransferasa capaz de transferir un azúcar, seleccionado del grupo que comprende hexosas y pentosas, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno o.

12. Un producto según las reivindicaciones 8 a 11, donde al menos el 20%, preferentemente al menos el 40% y más preferentemente, al menos el 60% de los residuos del antígeno O, son una N-acilperosamina distinta de N-formilperosamina; de forma preferida la N-acilperosamina es una N-acetilperosamina.

13. Un procedimiento para la obtención de un producto según las reivindicaciones 8 a 12 que comprende:

a) cultivar, en condiciones adecuadas, una bacteria gram-negativa modificada genéticamente mediante la introducción de un gen heterólogo que codifica

i) una N-aciltransferasa capaz de transferir un grupo acilo, distinto del

grupo forrnilo, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno O; o

ii) una N-glicosiltransferasa capaz de transferir un azúcar seleccionado del grupo que comprende hexosas y pentosas, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno O; donde la bacteria gram-negativa es preferentemente una Brucella según las

reivindicaciones 1 a 7; y b) aislar y/o purificar dicho producto.

14. Un procedimiento para la obtención de anticuerpos, que comprende:

a) inmunizar un animal con: i) una bacteria gram-negativa según las reivindicaciones 1 a 7, o ii) un producto según las reivindicaciones 8 a 12; y

b) aislar y/o purificar dichos anticuerpos.

15. Un anticuerpo específico frente a un antígeno O de un LPS, o de un NH, o de un precursor biosintético de los mismos, o de un fragmento de cualquiera de los anteriores, caracterizado porque

a) al menos uno de los residuos N-forrnilperosamina de dicho antígeno O, ha sido modíficado mediante la sustitución de al menos un grupo formilo, en posición 4-amino de la perosamina, por:

i) un grupo acilo, distinto del grupo formilo; donde el grupo acilo se selecciona preferentemente del grupo que comprende un grupo acetilo, un grupo 3-deoxi-L-glicerotetronilo, un grupo 3-hidroxipropionilo, un grupo S (+) 2-hidroxipropionilo, un grupo R ( -) 2-hidroxipropionilo, más preferentemente el grupo acilo es un grupo acetilo; o por

ii) un azúcar, seleccionado del grupo que comprende hexosas y pentosas; o b) dicho antígeno O comprende un heteropolimero formado por residuos

seleccionados entre:

i) N-formilperosamina y N-acilperosamina, donde esta Nacilperosamina es distinta de la N-forrnilperosamina, o

ii) N-formilperosamina y N-glicosilperosamina;

preferentemente el heteropolímero está formado por residuos seleccionados entre: N -formilperosamina y N -acetilperosamina, N -formilperosamina y 3-deoxi-L-glicerotetronilperosamina, N-formilperosamina y 3-hidroxipropionilperosamina, N -formilperosamina y S ( +) 2-hidroxipropionilperosamina, o también N -formilperosamina y R ( -) 2-hidroxipropionilperosamina;

más preferentemente el heteropolímero está formado por residuos Nformilperosamina y N-acetilperosamina.

16. Anticuerpo según la reivindicación 15, donde el antígeno O proviene de una bacteria gram-negativa del género Brucella según las reivindicaciones 1 a 7.

17. Un anticuerpo obtenible por un procedimiento según la reivindicación 14.

18. Una bacteria gram-negativa según las reivindicaciones 1 a 7, o un producto según las reivindicaciones 8 a 12, para uso en medicina.

19. Uso de una bacteria gram-negativa según las reivindicaciones 1 a 7, o un producto según las reivindicaciones 8 a 12, en la fabricación de un medicamento o de una vacuna.

20. Una bacteria gram-negativa según las reivindicaciones 1 a 7, o un producto según las reivindicaciones 8 a 12, para uso, según la reivindicación 19, en la prevención de la brucelosis.

2l. Uso, según la reivindicación 19, de una bacteria gram-negativa según las reivindicaciones 1 a 7, o un producto según las reivindicaciones 8 a 12, en la fabricación de un medicamento o de una vacuna para la prevención de la brucelosis.

22. Un medicamento para el tratamiento de la brucelosis, o una vacuna para la prevención de la aparición de dicha enfermedad que comprende una bacteria gram

negativa según las reivindicaciones 1 a 7, o un producto según las reivindicaciones 8

a 12.

23. Una bacteria gram-negativa según las reivindicaciones 1 a 7, un producto según las reivindicaciones 8 a 12 o un anticuerpo según las reivindicaciones 15 a l7, para uso en el diagnóstico de brucelosis; preferentemente para la diferenciación de animales infectados por Brucella de animales vacunados frente a Brucella.

24. Uso de una bacteria gram-negativa según las reivindicaciones 1 a 7, un producto según las reivindicaciones 8 a 12 o un anticuerpo según las reivindicaciones 15 a 17, en la fabricación de una composición, reactivo o kit, para diagnóstico de la brucelosis; preferentemente para la diferenciación de animales infectados por Brucella de animales vacunados frente a Brucella.

25. Uso de un marcador para diferenciar animales infectados por Brucella de animales vacunados frente a la Brucella, en donde dicho marcador se selecciona entre:

a) un antígeno O de un LPS, o de un NH, o de un precursor biosintético de los mismos, o de un fragmento de cualquiera de los anteriores, proveniente de una bacteria gram-negativa del género Brucella según las reivindicaciones 1 a 7;

b) un anticuerpo específico frente al antígeno O de un LPS, o de un NH, o de un precursor biosintético de los mismos, o de un fragmento de cualquiera de los anteriores, proveniente de una bacteria gram-negativa del género Brucella según las reivindicaciones 1 a 7;

c) una molécula de DNA o RNA que codifica:

i) una N-aciltransferasa capaz de transferir un grupo acilo, distinto del grupo formilo, a la posición 4-arnino de las perosaminas del antigeno O; donde el grupo acilo se selecciona preferentemente del grupo que comprende un grupo acetilo, un grupo 3-deoxi-L-glicerotetronilo, un grupo 3hidroxipropionilo, un grupo S (+) 2-hidroxipropionilo, un grupo R (-) 2hidroxipropionilo, y más preferentemente el grupo acilo es un grupo acetilo; o

ii) una N-glicosiltransferasa capaz de transferir un azúcar seleccionado

del grupo que comprende hexosas y pentosas, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno O; d) un anticuerpo específico frente a:

i) una N-aciltransferasa capaz de transferir un grupo acilo, distinto del grupo formilo, a la posición 4-arnino de las perosaminas del antígeno O; donde el grupo acilo se selecciona preferentemente del grupo que comprende un grupo acetilo, un grupo 3-deoxi-L-glicerotetronilo, un grupo 3hidroxipropionilo, un grupo S (+) 2-hidroxipropionilo, un grupo R ( -) 2hidroxipropionilo; y más preferentemente el grupo acilo es un grupo acetilo; o frente a

ii) una N-glicosiltransferasa capaz de transferir un azúcar seleccionado del grupo que comprende hexosas y pentosas, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno O; y

e) una combinación de los anteriores.

26. Un método de diagnóstico in vitro para diferenciar animales infectados por Brucella de animales vacunados frente a la Brucella, que comprende detectar la presencia en una muestra del animal de un marcador seleccionado entre:

a) un antígeno O de un LPS, o de un NH, o de un precursor biosintético de los mismos, o de un fragmento de cualquiera de ellos, proveniente de una bacteria gramnegativa del género Brucella según las reivindicaciones 1 a 7;

b) un anticuerpo específico frente a un antígeno O de un LPS, o de un NH, o de un precursor biosintético de los mismos, o de un fragmento de cualquiera de ellos, proveniente de una bacteria gram-negativa del género Brucella según las reivindicaciones 1 a 7;

c) una molécula de DNA o RNA que codifica

i) una N-aciltransferasa capaz de transferir un grupo acilo, distinto del grupo formilo, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno O; donde el grupo acilo se selecciona preferentemente del grupo que comprende un grupo acetilo, un grupo 3-deoxi-L-glicerotetronilo, un grupo 3-hidroxipropionilo, un grupo S ( +) 2

hidroxipropionilo, un grupo R (-) 2-hidroxipropionilo, y más preferentemente el grupo

acilo es un grupo acetilo; o

ii) una N-glicosiltransferasa capaz de transferir un azúcar seleccionado del grupo que comprende hexosas y pentosas, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno O; d) un anticuerpo específico frente a

i) una N-aciltransferasa capaz de transferir un grupo acilo, distinto del grupo formilo, a la posición 4-arnino de las perosaminas del antígeno O; donde el grupo acilo se selecciona preferentemente del grupo que comprende un grupo acetilo, un grupo 3-deoxi-L-glicerotetronilo, un grupo 3hidroxipropionilo, un grupo S (+) 2-hidroxipropionilo, un grupo R ( -) 2hidroxipropionilo, y más preferentemente el grupo acilo es un grupo acetilo; o frente a

ii) una N-glicosiltransferasa capaz de transferir un azúcar seleccionado del grupo que comprende hexosas y pentosas, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno O; y

e) una combinación de varios de los marcadores anteriores;

donde la presencia de al menos uno de dichos marcadores es indicativa de que dicho

animal ha sido vacunado frente a la brucelosis.

27. Método según la reivindicación 26, caracterizado porque es un inmunoensayo, preferentemente seleccionado entre un ELISA, un ensayo de aglutinación en placa y un ensayo de aglutinación en tubo.

28. Método según las reivindicaciones 26 o 27 que comprende las siguientes etapas:

a) detectar la presencia en la muestra de anticuerpos específicos frente a un antígeno O de un LPS, o de un NH, o de un precursor biosintético de los mismos, o de un fragmento de cualquiera de los anteriores, proveniente de una bacteria gramnegativa del género Brucella, distinta de una bacteria gram-negativa del género Brucella según las reivindicaciones 1 a 7; y

b) detectar la presencia en la muestra de anticuerpos específicos frente a un

antígeno O de un LPS, o de un NH, o de un precursor biosintético de los mismos, o de un fragmento de cualquiera de los anteriores, proveniente de una bacteria gramnegativa del género Brucella según las reivindicaciones 1 a 7.

29. Método según la reivindicación 28 que comprende, además, una etapa intermedia entre a) y b) en la que la muestra se pone en contacto con un ligando específico para absorber los anticuerpos detectados en a) .

30. Un kit de diagnóstico, para diferenciar animales infectados por Brucella de animales vacunados frente a la Brucella, que comprende al menos un componente seleccionado entre:

a) una sonda o ligando para anticuerpos específicos frente al antígeno O de un LPS o de un NH, o de un precursor biosintético de los mismos, o de un fragmento de cualquiera de los anteriores, donde dicho antígeno O proviene de una bacteria gramnegativa del género Brucella según las reivindicaciones 1 a 7;

b) un anticuerpo según las reivindicaciones 15 a 17;

c) una N-aciltransferasa capaz de transferir, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno O, un grupo acilo, distinto del grupo formilo; donde el grupo acilo se selecciona preferentemente del grupo que comprende un grupo acetilo, un grupo 3-deoxi-L-glicerotetronilo, un grupo 3-hidroxipropionilo, un grupo S ( +) 2hidroxipropionilo, un grupo R (-) 2-hidroxipropionilo, y más preferentemente el grupo acilo es un grupo acetilo;

d) una N-glicosiltransferasa capaz de transferir un azúcar seleccionado del grupo que comprende hexosas y pentosas, a la posición 4-amino de las perosaminas del antígeno O; y

e) un polinucleótido para amplificar un gen que codifica una N-aciltransferasa según c) o una N-glicosiltransferasa según d) ; preferentemente un polinucleótido para amplificar el gen wbdR de E. coli 0157:H7; más preferentemente la secuencia del polinucleótido es SEQ.ID.NO. 9, SEQ.ID.NO. 10, SEQ.ID.NO. ll, y SEQ.ID.NO. 12.

3l. Kit según la reivindicación 30, en donde la sonda o ligando a) para los anticuerpos específicos está seleccionado del grupo formado por: a) una bacteria gram-negativa del género Brucella según las reivindicaciones 1 a 7; y b) un producto según las reivindicaciones 8 a 12.

32. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 31 que comprende además al menos un reactivo seleccionado entre:

a) una molécula que comprende un antígeno O de un LPS, o de un NH, o de un precursor biosintético de los mismos, o de un fragmento de cualquiera de los anteriores, proveniente de una bacteria gram-negativa del género Brucella, distinta de una bacteria gram-negativa del género Brucella según las reivindicaciones 1 a 7; y

b) una bacteria gram-negativa del género Brucella, distinta de una bacteria gram-negativa del género Brucella según las reivindicaciones 1 a 7.

33. Un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada entre: SEQ.ID.NO. 1, SEQ.ID.NO. 2, SEQ.ID.NO. 3, SEQ.ID.NO. 4, SEQ.ID.NO. 5, SEQ.ID.NO. 6, SEQ.ID.NO. 9, SEQ.ID.NO. 10, SEQ.ID.NO. 11, o SEQ.ID.NO. 12.

34. Un polinucleótido que consiste en una secuencia seleccionada entre: SEQ.ID.NO. 1, SEQ.ID.NO. 2, SEQ.ID.NO. 3, SEQ.ID.NO. 4, SEQ.ID.NO. 5, SEQ.ID.NO. 6, SEQ.ID.NO. 9, SEQ.ID.NO. 10, SEQ.ID.NO. 11, y SEQ.ID.NO. 12.

35. Un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 33 o 34 para uso en el diagnóstico de la brucelosis.

36. Uso de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 33 o 34 para la fabricación de una composición, un reactivo o un kit para el diagnóstico de la brucelosis.