Método para extraer selectivamente proteínas de membrana, es decir,

proteínas asociadas a membranas biológicas, que comprende una etapa que consiste en poner en contacto una solución acuosa que comprende una o varias proteínas de membrana de la proteína de membrana que se va a extraer con al menos un calixareno, caracterizado porque el calixareno es un calixareno de fórmula (I):

en donde:

- n es un número entero igual a 1, 3, 5 o 6;

- R1, R2, R3, R4 independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno;

un grupo alquilo (C1-12) lineal o ramificado, eventualmente sustituido con uno o varios heteroátomos seleccionados entre el grupo de átomos O, S, N y P; un grupo alquilo (C1-12) lineal o ramificado, eventualmente sustituido con un grupo -COOR en donde R es un grupo alquilo (C1-4) lineal o ramificado; un grupo arilo que comprende de 6 a 20 átomos de carbono;

- X1, X2 y X3 independientemente uno de otro representan un grupo -(CH2)m-COOR' en donde

- m es un número entero de 0 a 10,

- R' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (C1-4) lineal o ramificado;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Metodo de extracción selectiva de proteinas de membrana con calixarenos Campo tecnico La presente invención se refiere a un metodo para extraer selectivamente proteinas de membrana con al menos un 5 calixareno.

El uso de calixarenos en el metodo de acuerdo con la invención permite la solubilización selectiva de las proteinas de membrana, a la vez que se conserva su estructura tridimensional que es esencial para su actividad enzimatica.

En la descripción que sigue, las referencias que figuran entre corchetes [ ] se refieren a la lista de referencias que fi

gura al final del texto.

Estado de la tecnica La extracción de las proteinas de membrana es una etapa requerida previamente para su estudio en solución, en particular su caracterización estructural por cristalografia de rayos X, que implica mantenerlas en solución en un estado topológico identico al que adoptan en las membranas.

En general, esta etapa se efectua con ayuda de detergentes o tensioactivos que, por un lado, hacen posible la ex

tracción de estas proteinas de su medio membranal, desestructurando la bicapa de la membrana compitiendo con las cadenas alifaticas de los lipidos que la constituyen y, por otro lado, mantienen la proteina de la membrana en solución debido a su componente hidrófilo. Sin embargo, estos detergentes no muestran las mismas caracteristicas fisicoquimicas que los lipidos y, por lo tanto, tienden a desestabilizar la estructura de los dominios de la membrana, lo que es una fuente de heterogeneidad estructural.

A pesar de que son los mas eficaces para solubilizar las proteinas de membrana, los detergentes o los tensioactivos aniónicos, como por ejemplo, dodecil sulfato s6dico (SOS) o desoxicolato de sodio, son generalmente desestructurantes. Ademas, la eficacia de la fase de desestructuración de la bicapa lipidica es una función de la longitud de la cadena alifatica del detergente o del agente tensioactivo, un parametro que varia en función del origen de las membranas y de las proteinas que se insertan en ella.

Ademas, se conocen diversos estudios sobre las interacciones de diversos calixarenos con proteinas, pero no permiten la extracción de las proteinas de membrana de su medio membranal, y en particular, sin una desnaturalización de las mismas.

El documento de Oshima F. y col. (LANGMUIR, vol. 21, paginas 7280782, 2005) describe el uso de un calix[6]areno especifico para la extracción selectiva del citocromo c.

El documento de patente WO 89/08092 describe que ciertos calix[48]arenos son aptos para extraer hidrocarburos.

En el contexto de la presente invención, los terminos "agente tensioactivo", "tensioactivo" y "detergente" se utilizan indistintamente para designar moleculas que tienen propiedades particulares debido a su estructura anfifilica. Una molecula se dice que es anfifilica cuando posee simultaneamente un grupo polar e hidrófilo y un grupo apolar e hidrófobo.

La expresión "extracción selectiva" en la presente invención, significa un metodo que permite extraer las proteinas de membrana, selectivamente unas respecto a las otras, desde un medio de membrana mediante solubilización de las membranas lipidicas en las que estas proteinas estan insertadas, sean naturales o artificiales, y la disolución de dichas proteinas.

En el sentido de la presente invención, la "solubilización" o "puesta en solución" de proteinas de la membrana, signi

fica el paso de la proteina de membrana desde el medio membranal, es decir, desde un medio esencialmente lipidico, a un medio acuoso. En el medio acuoso, las proteinas "solubilizadas" pueden estar en suspensión, en dispersión o en forma de moleculas que no estan libres en la solución acuosa. Oichas proteinas se pueden asociar o ligar eventualmente con tensioactivos o detergentes.

En la actualidad, existen muy pocos detergentes polianiónicos no desnaturalizantes para las proteinas de membrana 45 que permitan su extracción selectiva.

Por lo tanto, existe una necesidad real de un metodo de extracción que mitigue los defectos, las limitaciones y las desventajas y obstaculos de la tecnica anterior, en particular de un metodo que emplee moleculas aniónicas que tengan propiedades detergentes que permitan extraer selectivamente las proteinas de la membrana sin desnaturalizarlas, es decir, sin desestructurar o sin modificar su conformación tridimensional normal que les permite cumplir su 50 función.

Descripcion de la invencion El objeto de la presente invención es precisamente responder a esta necesidad, proporcionando un metodo para extraer selectivamente las proteinas de membrana, que comprende una etapa que consiste en poner en contacto una solución acuosa de la proteina de membrana que se va a extraer, con al menos un calixareno de fórmula (I) :

en donde:

• n es un numero entero igual a 1, 3, 5 o 6;

º R1, R2, R3 y R4 independientemente uno de otro, representan un atomo de hidr6geno, un grupo alquilo (C112) (por ejemplo alquilo (C312) , por ejemplo alquilo (C912) ) , lineal o ramificado, eventualmente sustituido con uno o varios

heteroatomos seleccionados entre el grupo de atomos O, S, N y P; un grupo alquilo (C112) (por ejemplo alquilo (C312) , por ejemplo alquilo (C912) ) , lineal o ramificado, eventualmente sustituido con un grupo COOR en donde R es un grupo alquilo (C14) lineal o ramificado; o un grupo arilo que comprende de 6 a 20 atomos de carbono;

º X1, X2 y X3 independientemente uno de otro, representan un grupo (CH2) mCOOR' en donde m es un numero entero de 0 a 10, 15 R' representa un atomo de hidr6geno o un grupo alquilo (C14) lineal o ramificado;

o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.

Oe acuerdo con una realización particular de la invención, el metodo para la extracción selectiva de la proteina de membrana se puede llevar a cabo utilizando al menos un calixareno de fórmula (I) en la que:

• n es un numero entero igual a 1;

º R1, R2, R3 y R4 independientemente uno de otro, representan un atomo de hidr6geno; un grupo alquilo (C112) lineal o ramificado;

º X1, X2 y X3 independientemente uno de otro, representan un grupo (CH2) mCOOR' en el que m es un numero entero de 0 a 10, R' representa un atomo de hidr6geno;

o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.

En el sentido de la presente invención, "alquilo" significa un radical que contiene carbono, lineal, ramificado o ciclico, saturado o insaturado, eventualmente sustituido, que comprende de 1 a 12 atomos de carbono. A titulo indicativo, se pueden citar los radicales metilo, etilo, propilo, butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecanilo y sus is6meros ramificados. El grupo alquilo puede estar eventualmente sustituido con uno o varios heteroa

tomos seleccionados entre el grupo de atomos O, S, N, P.

El termino "arilo" designa de manera general un sustituyente aromatico ciclico que contiene de 6 a 20 atomos de carbono. En el contexto de la invención, el grupo arilo puede ser mono o policiclico y estar eventualmente sustituido. Como tales, se pueden citar el bencilo y el fenilo.

En el contexto de la presente invención, la expresión "sales farmaceuticamente aceptables" abarca las sales prepa

radas con acidos o bases no t6xicas, dependiendo de los sustituyentes presentes en los compuestos. Cuando los compuestos de la invención contienen funciones acidas, las sales correspondientes pueden obtenerse mediante la adición de una base organica o inorganica en el compuesto en forma neutralizada, eventualmente en presencia de un disolvente preferentemente inerte. Ejemplos de sales de adición de una base pueden ser las sales de sodio, potasio, calcio, amonio, amino (organico) o magnesio. Cuando los compuestos de la invención contienen funciones basicas, las sales correspondientes se pueden obtener por adición de un acido organico o inorganico, eventualmente en un disolvente preferentemente inerte. Ejemplos de sales de adición de acido inorganico, pueden ser clorohidrato, bromohidrato, nitrato, carbonato, monohidrogenocarbonato, fosfato, monohidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, sulfato, sulfato, monohidrogenosulfato, yodohidrato. Ejemplos de sales de adición de acido organico pueden ser acetato, propionato, isobutirato, maleato, malonato, benzoato, succinato, suberato, fumarato, lactato, mandelato, ftalato, bencenosulfonato,... [Seguir leyendo]

REIvINDICACIONES

1. Metodo para extraer selectivamente proteinas de membrana, es decir, proteinas asociadas a membranas biológicas, que comprende una etapa que consiste en poner en contacto una solución acuosa que comprende una o varias proteinas de membrana de la proteina de membrana que se va a extraer con al menos un calixareno, caracterizado porque el calixareno es un calixareno de fórmula (I) :

en donde:

• n es un numero entero igual a 1, 3, 5 o 6;

º R1, R2, R3, R4 independientemente uno de otro, representan un atomo de hidr6geno; un grupo alquilo (C112) lineal

o ramificado, eventualmente sustituido con uno o varios heteroatomos seleccionados entre el grupo de atomos O, S, N y P; un grupo alquilo (C112) lineal o ramificado, eventualmente sustituido con un grupo COOR en donde R es un grupo alquilo (C14) lineal o ramificado; un grupo arilo que comprende de 6 a 20 atomos de carbono;

º X1, X2 y X3 independientemente uno de otro representan un grupo (CH2) mCOOR' en donde m es un numero entero de 0 a 10, 15 R' representa un atomo de hidr6geno o un grupo alquilo (C14) lineal o ramificado;

o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.

2. Metodo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la extracción selectiva de la proteina de membrana se lleva a cabo utilizando al menos un calixareno de fórmula (I) en la que:

• n es un numero entero igual a 1; 20 º R1, R2, R3, R4 independientemente uno de otro, representan un atomo de hidr6geno; un grupo alquilo (C112) lineal o ramificado;

º X1, X2 y X3 independientemente uno de otro, representan un grupo (CH2) mCOOR' en donde m es un numero entero de 0 a 10, R' representa un atomo de hidr6geno;

o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.

3. Metodo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la proteina de membrana que se va a extraer esta presente en una fracción de membrana biológica derivada de un organismo procariota o eucariota, sano o alterado.

4. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteina de membrana es 30 una proteina seleccionada entre el grupo que comprende las proteinas de transporte.

5. Metodo de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la proteina de transporte es un transportador ABC, seleccionado entre el grupo que comprende las glicoproteinas P (Pgp/ABCB1) , MRP1/ABCC1, BCRP/ABCG2 y BmrA.

6. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la etapa de puesta en con

tacto de una solución acuosa que comprende la proteina de membrana que se va a extraer con al menos un calixareno de fórmula (I) se efectua a un pH que varia de 5, 5 hasta 10.

7. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la etapa de puesta en con tacto de una solución acuosa que comprende la proteina de membrana que se va a extraer con al menos un calixa5 reno de fórmula (I) se efectua a una temperatura que varia de 0 a 100°C.

8. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la etapa de puesta en contacto de una solución acuosa que comprende la proteina de membrana que se va a extraer con al menos un calixareno de fórmula (I) se efectua a una concentración de calixareno que oscila entre 106 a 102 M.

9. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la etapa de puesta en con tacto de una solución acuosa que comprende la proteina de membrana que se va a extraer con al menos un calixareno de fórmula (I) se efectua con calixarenos en solución o con calixarenos en agregados coloidales.

10. Metodo de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el agregado coloidal se selecciona entre el grupo que comprende micelas, liposomas y nanoparticulas lipidicas.

11. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la etapa de puesta en con tacto de una solución acuosa que comprende la proteina de membrana que se va a extraer con al menos un calixareno de fórmula (I) se efectua eventualmente en presencia de al menos un cosoluto seleccionado entre el grupo que comprende:

i) sales organicas e inorganicas seleccionadas entre el grupo que comprende sales farmaceuticamente aceptables;

ii) pequefas moleculas bioactivas seleccionadas entre el grupo de los aminoacidos, vitaminas, lipidos, esteroides, carbohidratos o metabolitos;

iii) moleculas bioactivas oligómeras seleccionadas entre el grupo de los peptidos, oligonucleótidos, oligosacaridos;

iv) moleculas biológicas polimeras seleccionadas entre el grupo de las proteinas, polinucleótidos y polisaca25 ridos.

12. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la etapa de puesta en contacto esta precedida por una etapa en la cual:

la proteina de membrana que se va a extraer o la fracción de membrana que la contiene se disuelve en una solución tampón, y el calixareno de fórmula (I) se afade de acuerdo con las condiciones descritas en las reivindicaciones 6 a 11.

13. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde las proteinas que forman un complejo con los calixarenos de fórmula (I) y las proteinas que no forman un complejo se separan por centrifugación.

14. Proteina de membrana que forma un complejo con al menos un calixareno de fórmula (I) tal y como se define en la reivindicación 1, obteniendose dicha proteina de membrana que forma un complejo por un metodo de extracción de acuerdo con la reivindicación 13.

ºigura 1