Método de estabilización, y azulado, de pigmento de antocianina usando un gen que codifica transferasa de acilo aromático a la posición 3'' de la antocianina.

Un método para añadir grupos acilo aromático a azúcares en las posiciones tanto 3' como de una antocianina,

comprendiendo el método la etapa de:

usar un gen que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC: 4 o 6, o un gen que codifica una proteína que tiene una identidad de secuencia de 90% o más con la secuencia de aminoácidos que se indica en el Nº ID SEC: 4 o 6 y que tiene una actividad de transferencia de grupos acilo aromático a azúcares en las posiciones tanto 3' como de la antocianina

Método de estabilización, y azulado, de pigmento de antocianina usando un gen que codifica transferasa de acilo aromático a la posición 3' de la antocianina.

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a un método para alterar la antocianina hacia más azul y más estable usando una enzima que transfiere un grupo acilo aromático a las posiciones 3' y 5 de la antocianina o un gen que codifica dicha enzima, y puede aplicarse para la alteración y la estabilización de pigmentos de antocianina y a la alteración y la estabilización del color de las flores. Más específicamente, se refiere a un método para volver azul el color de las flores y estabilizarlo usando una acil (aromático) transferasa que transfiere un grupo acilo aromático a las posiciones 3' Y 5 de antocianina derivada de plantas incluyendo Gentiana triflora var. japonica o un cONA que codifica dicha enzima.

La presente invención se refiere a un método para alterar la antocianina hacia más azul y más estable usando una sola enzima que transfiere grupos acilo aromático a azúcares en múltiples posiciones de la antocianina o un gen que codifica dicha enzima, y puede aplicarse para la alteración y la estabilización de pigmentos de antocianina y para la alteración y la estabilización del color de las flores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

La industria de las flores se esfuerza para desarrollar variedades de flores nuevas y diferentes. Un modo eficaz de crear tales nuevas variedades es la manipulación del color de las flores, en la que se han usado técnicas de reproducción clásicas para producir una amplia gama de colores para la mayoría de las variedades comerciales. Sin embargo, este enfoque se ha limitado por las restricciones de un acervo génico de una especie particular y por esta razón es raro que una especie individual tenga el espectro completo de variedades coloreadas.

El color de las flores se debe predominantemente a dos tipos de pigmentos: los flavonoides y los carotenoides. Los flavonoides contribuyen principalmente a una amplia gama de color del amarillo al rojo al azul, mientras que los carotenoides contribuyen principalmente a tonos cromáticos tales como naranja o amarillo. Los flavonoides que son una contribución principal al color de las flores son una clase de compuestos denominados antocianinas. El grupo cromóforo de las antocianinas es el de las antocianidinas, y, como antocianidinas principales, se conocen la pelargonidina, la cianidina y la delfinidina. Se sabe que las plantas tienen una amplia variedad de antocianinas, y su diversidad es una de las causas de la diversidad de colores de las flores. Ya se han determinado las estructuras de cientos de antocianinas, y el grupo hidroxilo en la posición 3 de la mayoría de las antocianinas se ha modificado con azúcares (Harbone, en The Flavonoids: 565, 1986) .

La ruta biosintética para las antocianinas es común entre las plantas con flores hasta la biosíntesis de los 3glucósidos (Holton et ál., Plant Cell 7: 1071, 1995) , Ysubsiguientemente sufren diversas modificaciones tales como glicosilación, acilación y metilación en modos específicos para la especie y la variedad. Tales diferencias en los patrones de modificación en las variedades son una de las razones de las diversidades en la antocianinas, es decir las diversidades en los colores de las flores. Generalmente, cuantos más grupos acilo aromático modifiquen las antocianinas, las antocianinas se hacen más estabilizadas y más azules (Harbone, en the Flavonoids: 565, 1986; Norio Saito, TANPAKUSITU KAKUSAN KOUSO (Proteins, Nucleic Acids, Enzymes) 47: 202, 2002) . Por otra parte, el color de las flores puede estar afectado por la formación de un complejo metálico de antocianinas, el efecto de copigmentación de compuestos flavonoides tales como flavonol y flavona y el pH de las vacuo las en las que se localizan las antocianinas (Forkmann, Plant Breeding 106: 1, 1991) .

La biosíntesis de flavonoides incluyendo antocianidina se ha estudiado intensivamente. Todos los genes para enzimas implicadas en la biosíntesis de antocianinas se han clonado, y también se han obtenido genes para los factores de transcripción para las mismas. Por lo tanto, la modificación artificial de la expresión de estos genes puede alterar la estructura y la cantidad de flavonoides acumulados en las flores, y de ese modo puede cambiar el color de las flores. Existen algunos informes sobre la modificación de estructuras de antocianina y el color de las flores mediante una técnica de biología molecular y la transformación génica en plantas (Forkmann G. & Martens S. (2001) , Cure. Opin. Biotechnology, 12: 155-160; Tanaka Y. & Mason J. (2003) , En: Singh RP & Jaiwal PK (ed.) Plant genetic engineering, pp. 361-385, SCI tech publishing, Houston) .

Un posible método para hacer azul el color de las flores es incrementar el número de grupos hidroxilo del anillo B de la antocianina. Una enzima que cataliza una reacción de hidroxilación de la posición 3' de la antocianina (flavonoide 3'-hidroxilasa: F3'H) y una enzima que cataliza una reacción de hidroxilación de la posición 3' y 5' de la antocianina (flavonoide 3', 5'-hidroxilasa: F3'5'H) son importantes para alterar el color de las flores. En general, la pelargonidina (un grupo hidroxilo en el anillo B) está contenida en flores de color naranja a rojo, la cianidina (dos grupos hidroxilo en el anillo B) está contenida en flores de color rojo a magenta y la delfinidina (tres grupos hidroxilo en el anillo B) está contenida en flores de color púrpura a azul. En la mayoría de los casos, las especies de plantas que no tienen variedades de color púrpura a azul a menudo carecen de capacidad para producir delfinidina, y están representadas por las rosas, los crisantemos y los claveles.

Para estas plantas, la creación de variedades de color púrpura a azul mediante biotecnología ha atraído atención desde hace mucho tiempo. De hecho, al expresar el gen de F3'5'H esencial para la producción de delfinidina, se producían claveles cuyo color era púrpura azulado (Tanaka Y. & Mason J. (2003) , En: Singh RP & Jaivval PK (ed.) Plant genetic engineering, pp. 361-385, SCI tech publishing, Houston) , y se hacia posible producir delfinidina en los pétalos de las flores, pero sin embargo el color de las flores no ha sido totalmente azul. Así, a fin de hacer el color de las flores azul puro, no es suficiente la introducción del gen de F3'5'H solo, y pueden requerirse estrategias adicionales.

Realmente, las antocianinas contenidas en las flores azules a menudo están modificadas con grupos acilo aromático a través de azúcares (Honda & Saito, Heterocycles 56: 633 (2002) ) . Por tanto, un posible método para hacer azul el color de las flores es modificar las antocianinas con grupos acilo aromático tales como grupos cafeoílo, grupos cumaroilo y grupos sinapoilo (Tanaka Y. & Mason J. (2003) , En: Singh RP & Jaivval PK (ed.) Plant genetic engineering, pp. 361-385, SCI tech publishing, Houston) .

Generalmente, la antocianina se enrojece ligeramente mediante glicosilación, y la adición de grupos acilo aromático a través de azúcares hace azul el color de la antocianina (Forkmann, Plant Breeding 106: 1, 1991) . Además, la antocianina es un compuesto inestable en soluciones neutras, y la estabilidad se mejora mediante la modificación con azúcares o grupos acilo (Forkmann, Plant Breeding 106: 1, 1991) . Un experimento que usa antocianinas procedentes de dondiegos de día (Pharbitis nil) revelaba que las antocianinas aciladas a las que se unía un grupo acilo aromático tal como, por ejemplo, ácido cumárico o cafeico, mostraba un desplazamiento hipsocrómico (Oangle et ál., Phytochemistr y 34: 1119, 1993) .

En cuanto a las antocianinas aciladas con grupos acilo aromático, se han presentado muchos ejemplos de aislamiento de la naturaleza, incluyendo avvobanina (Goto y Kondo, Angew. Chern. In!. Ed. Engl. 30: 17, 1991) derivada de Commelina communis (Honda & Saito, Heterocycles 56: 633 (2002) ) . Por ejemplo, las antocianinas procedentes de flores azules tienen múltiples grupos acilo aromático según se representa por la cinerarina (derivada de cineraria) , la gentiodelfina (derivada de Gentiana triflora) , la antocianina azul cielo (derivada de Pharbitis nil) , la ternatina (derivada de Clitoria ternatea) y la lobelinina (derivada de Lobelia) .

La cinerarina (Goto et ál., Tetrahedron 25: 6021, 1984) derivada de cineraria (Senecio cruentus) tiene un grupo acilo alifático y tres grupos acilo aromático, y se presenta que estos grupos acilo aromático... [Seguir leyendo]

1. Un método para añadir grupos acilo aromático a azúcares en las posiciones tanto 3' como 5 de una antocianina, comprendiendo el método la etapa de:

usar un gen que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en el N° ID SEC: 4

o 6, o un gen que codifica una proteína que tiene una identidad de secuencia de 90% o más con la secuencia de aminoácidos que se indica en el N° ID SEC: 4 o 6 y que tiene una actividad de transferencia de grupos acilo aromático a azúcares en las posiciones tanto 3' como 5 de la antocianina.