Método de determinación de nucleótidos en alimentos mediante cromatografía líquida de pares iónicos con detección por fotodiodos acoplada a espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización dual operando en modo negativo (HPLC/ESI-APCI-TOF-MS).

El método permite la determinación rápida de los cinco nucleótidos monofosfato autorizados en alimentos infantiles (citidina 5'-monofosfato, uridina 5'-monofosfato, adenosina 5'-monofosfato, inosina 5'-monofosfato y guanosina 5'-monofosfato), y comprende la precipitación previa de las proteínas de los alimentos y el análisis directo de los nucleótidos en el extracto resultante por HPLC de pares iónicos usando elución isocrática. La recuperación obtenida para muestras fortificadas fue satisfactoria para todos los analitos. El procedimiento propuesto permite la determinación de los únicos nucleótidos autorizados y se ha aplicado con éxito al análisis de diferentes muestras de alimentos infantiles y funcionales, tales como purés, cereales y potitos.

MÉTODO DE DETERMINACiÓN DE NUCLEÓTICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE CROMATOGRAFíA LíQUIDA DE PARES IÓNICOS CON DETECCiÓN POR FOTODIODOS ACOPLADA A ESPECTROMETRíA DE MASAS

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a la determinación de nucleótidos en alimentos, particularmente en alimentos infantiles, mediante la precipitación de las proteínas de la muestra y la determinación de los nucleótidos en el extracto resultante mediante cromatografía líquida (HPLC) de pares iónicos con detección por fotodiodos (DAD) acoplada a espectrometría de masas (MS) .

INTRODUCCiÓN

Los nucleótidos son monómeros constituidos por un grupo fosfato, un azúcar de cinco átomos de carbono (ribosa o deoxiribosa) y uno o dos anillos de una base que contiene nitrógeno. Son parte esencial de los ácidos nucleicos, quizás los constituyentes fundamentales y más importantes de las células [1]. Se han reconocido como elementos importantes en la nutrición de los mamíferos especialmente durante períodos de crecimiento rápido o estrés fisiológico, y además juegan un papel crucial en la función eficiente del sistema inmunológico. Muchos tejidos no son capaces de sintetizar los nucleótidos y los hombres deben incorporarlos a través de la dieta [2]. En muchos procesos bioquímicos, los nucleótidos primarios monofosfato se usan para producir metabolitos intermedios a través de una serie de reacciones enzimáticas. La adición de nucleótidos primarios a la dieta proporciona una fuente real en la síntesis de intermediarios.

Los nucleótidos se encuentran abundantemente en la leche humana y cuando la lactancia materna no es posible, se recomienda una fórmula enriquecida. Para gente joven sana, su ingesta a través de la dieta es suficiente; sin embargo, en la mayoría de los alimentos, las cantidades de nucleótidos útiles son muy bajas comparadas con sus necesidades. Todos los ingredientes de origen animal y vegetal que contienen material celular son fuentes potenciales, usualmente en forma de nucleoproteínas. El contenido es particularmente elevado en ingredientes tales como proteínas solubles de origen animal, legumbres y extractos de levadura. El contenido, proporción y disponibilidad difiere entre ellos. El músculo es una fuente pobre de nucleótidos, al igual que las semillas, soja, cereales, frutas, verduras y productos procesados de la leche [3]. Entre las fuentes de origen marino, las anchoas y sardinas, por ejemplo, tienen niveles muy altos de guanina. La disponibilidad también es un factor muy importante. Las proteínas solubles de pescado y origen animal son altamente digestivas y afectan la disponibilidad total [4].

Hay un gran interés sobre la importancia de los nucleótidos de la dieta en la nutrición infantil. Los alimentos infantiles combinan una gran variedad de matrices [5]: alimentos no grasos basados en frutas y verduras (contenido de grasa inferior al 2%) , alimentos grasos basados en carne/huevos/queso y alimentos basados en cereales con diferentes contenidos de grasa. Ya que los alimentos derivados de las plantas y de la leche tienen escasos contenidos de nucleótidos, la suplementación con la dieta puede ser de particular interés para los niños que no sólo se alimentan de leche. Los nucleótidos permitidos en las formulas infantiles son cinco compuestos, citidina 5'-monofosfato (CMP) , uridina 5'-monofosfato (UMP) , adenosina 5'-monofosfato (AMP) , guanosina 5'monofosfato (GMP) e inosina 5'-monofosfato (IMP) [6]. Sin embargo, no existe información sobre los niveles de nucleótidos en algunos alimentos infantiles tales como cereales y purés y tampoco hay niveles establecidos para el suplemento de los alimentos infantiles.

Los nucleótidos son compuestos inestables y relativamente no volátiles y el método utilizado generalmente para su análisis en alimentos ha sido HPLC. Sin embargo, su separación se lleva a cabo generalmente mediante intercambio aniónico o fase reversa con pares de iones, debido a que tienen una elevada polaridad y naturaleza aniónica. Así, se han propuesto diferentes métodos mediante HPLC para la separación y determinación de los nucleótidos en fórmulas infantiles o matrices biológicas [7-36] usando distintos sistemas de detección, fundamentalmente DAD y MS. No obstante, en los alimentos no suplementados (tales como ciertos alimentos infantiles) , los niveles de nucleótidos son muy bajos y, al ser la matriz muy compleja, los métodos existentes presentan un problema de falta de sensibilidad y de seguridad en la identificación de los nucleótidos con total certeza.

En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de un método de determinación de los cinco nucleótidos autorizados en alimentos infantiles, a saber 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-AMP, 5'-GMP Y 5'-IMP, que tenga una elevada sensibilidad para dichos nucleótidos además de una elevada seguridad en la identificación de los mismos.

Este problema ha sido resuelto en el método de la invención a través de una primera etapa de precipitación de las proteínas de la muestra seguida por el análisis del extracto mediante acoplamiento de HPLC de pares iónicos con detección por fotodiodos (DAD) acoplada a espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF-MS) con dual electrospray e ionización química a presión atmosférica (HPLC/ESI-APCI-TOF-MS) . En particular, el uso del reactivo volátil formador de pares de iones N, N-dimetilhexilamina (DMHA) ha permitido mejorar la compatibilidad de HPLC de pares iónicos con ESI-APCI-TOF-MS. Hasta el conocimiento de los inventores, este es el primer estudio en el que se han determinado rápidamente los cinco nucleótidos autorizados en una gran variedad de alimentos infantiles y/o funcionales tales como cereales y purés, sin y con suplementación.

En consecuencia, un primer aspecto de la invención se dirige a un método de determinación en un alimento de al menos un nucleótido seleccionado del grupo que consiste en: monofosfato citidina 5'-monofosfato, uridina 5'monofosfato, adenosina 5'-monofosfato, inosina 5'-monofosfato y guanosina 5'monofosfato, sólo o en cualquier combinación entre ellos, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) precipitar las proteínas del alimento con ácido acético o ácido tricloroacético y a continuación separar el precipitado, obteniendo un extracto;

b) someter el extracto obtenido a cromatografía líquida (HPLC) de pares iónicos con detección por fotodiodos acoplada a espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización dual ESI-APCI operando en modo negativo, caracterizado porque la fase móvil del sistema HPLC comprende N, Ndimetilhexilamina (DMHA) a una concentración entre 5 y 25 mM como reactivo formador de pares de iones.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS

Fig. 1. Cromatogramas obtenidos para una mezcla de nucleótidos estándar de 1 IJg mL-1 usando HPLC de pares iónicos. A: Cromatograma mediante HPLC/DAD a 260 nm; B-F: Cromatogramas de los iones extraídos mediante HPLC/ESI-APCI-TOF-MS mostrando los espectros de los compuestos.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN.

1. Instrumentación utilizada El sistema HPLC es Agilent 1200 (Agilent, Waldbronn, Germany) compuesto por una bomba binaria (G1312A) operando con una velocidad de flujo de 0, 7 mL min-1. Los disolventes se desgasificaron usando un sistema de membrana en línea (Agilent G1379A) . La columna se mantuvo en un compartimento termostatado a temperatura ambiente (Agilent G1316A) . El detector de diodos es Agilent G1315D operando a tres longitudes de onda: 252, 260 Y 271 nm. La separación se llevó a cabo en una columna Gemini®-NX 5 IJm C18 (150 x 4.6 mm) , que proporcionó elevada eficiencia y resistencia mecánica en un intervalo de pH muy amplio de 1-12. La inyección (40 IJL) se llevó a cabo con un automuestreador (Agilent G1329A) . El sistema HPLC se acopló a un espectrómetro de masas TOF/Q-TOF (Agilent 6220) equipado con una interfase dual ESI-APCI. Las disoluciones se almacenaron en viales de vidrio de color ámbar de 2 o 10 mL. Para la extracción de las muestras se utilizó una centrífuga EBA 20 (Hettich, Tuttlingen, Germany) y un baño de ultrasonidos (Selecta, Barcelona, Spain) .

2. Reactivos Se utilizó acetonitrilo y metanol grado reactivo de Lab-Scan (Dublin, Ireland) . El agua desionizada se obtuvo con un sistema de purificación Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) . Los nucleótidos comerciales 5'-monofosfato, 5'-CMP, 5'AMP, 5'-GMP, 5'-IMP Y 5'-UMP, se obtuvieron como sales sódicas de Sigma (St. Louis, MO, USA) . Las disoluciones concentradas (1000 I-Ig mL-1) se prepararon disolviendo los productos comerciales, sin purificación... [Seguir leyendo]

1) Método de determinación en un alimento de al menos un nucleótido seleccionado del grupo que consiste en: monofosfato citidina 5'monofosfato, uridin.

5. monofosfato, adenosin.

5. monofosfato, inosin.

5. monofosfato y guanosin.

5. monofosfato, sólo o en cualquier combinación entre ellos, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) precipitar las proteínas del alimento con ácido acético o ácido tricloroacético y a continuación separar el precipitado, obteniendo un extracto;

b) someter el extracto obtenido a cromatografía líquida (HPLC) de pares iónicos con detección por fotodiodos acoplada a espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización dual ESI-APCI-TOF-MS operando en modo negativo, caracterizado porque la fase móvil del sistema HPLC comprende N, Ndimetilhexilamina (DMHA) a una concentración entre 5 y 25 mM como reactivo formador de pares de iones.

2) Método según la reivindicación 1, en el que la fase móvil del sistema HPLC comprende N, N-dimetilhexilamina (DMHA) a una concentración de aproximadamente 20 mM.

3) Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 precedentes, en el que la fase móvil del sistema HPLC comprende además 5% (v/v) metanol y 95% (v/v) disolución reguladora de formiato 0, 1 M a un pH entre 5 y 6, Y la elución es isocrática.

4) Método según la reivindicación 3, en el que el pH es de aproximadamente 5, 5.

5) Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 anteriores, en el que, en la etapa a) , las proteínas del alimento son precipitadas con ácido tricloroacético a una concentración entre 0, 1 Y 1 % m/v.

6) Método según la reivindicación 5, en el que, en la etapa a) , las proteínas del alimento son precipitadas con ácido tricloroacético a una concentración de alrededor de 0, 6% m/v.

7) Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que, previamente a la etapa b) , el extracto obtenido de la etapa a) es filtrado.

8) Método según la reivindicación 7, en el que el filtrado del extracto se 10 realiza mediante filtro de difluoruro de polivinilideno (PVDF) .

9) Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fase móvil es eluida a una velocidad de flujo de 0, 7 mL min-1.

10) Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de HPLC se lleva a cabo con un voltaje capilar de +1 kV.

11) Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el alimento es un alimento infantil o un alimento funcional. 20 12) Método según la reivindicación 11, en el que el alimento es un potito o puré infantil.