PROCEDIMIENTO PARA MEJORAR LA PERMEABILIDAD CELULAR A PARTÍCULAS FORÁNEAS.

Procedimiento para mejorar la permeabilidad celular a partículas foráneas Campo de la invención La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para mejorar la permeabilidad celular hacia partículas foráneas que incluyen las sondas de la presente invención. Antecedentes Las células son la unidad básica de todos los organismos vivos. La característica común de casi todas las células es que están rodeadas (o limitadas) por una membrana citoplasmática. Esta membrana alberga los contenidos internos de la célula y regula el movimiento de sustancias hacia dentro y fuera de la célula. Sólo aquellas moléculas que se pueden difundir a través de la membrana o son transportadas a través de la misma se pueden mover hacia el interior y el exterior de la célula. Algunas pueden traspasar el núcleo lipídico de la membrana, pero otras deben pasar a través de los poros. Otras moléculas más deben atravesar la membrana unidas a vehículos de una manera energéticamente dependiente. Asimismo, el núcleo y otros orgánulos celulares tienen membranas que regulan el flujo de moléculas hacia el interior y el exterior del orgánulo. La fijación es un proceso químico que fija las moléculas celulares en su sitio de manera que luego sea posible estudiar la célula o el tejido. La mayoría de los agentes que se usan como fijadores (p.ej., alcoholes, tales como etanol y aldehídos, tales como paraformaldehído) funcionan mediante el entrecruzamiento de moléculas celulares, especialmente, de proteínas. Este procedimiento de entrecruzamiento evita la degradación de la estructura celular. Hay diversos fijadores que están mejor adaptados a la conservación de diferentes moléculas y estructuras celulares o a diferentes procedimientos de detección. El fijador seleccionado para cualquier objetivo particular estará determinado por la naturaleza del objetivo. Desafortunadamente, los procedimientos actuales de fijación suelen dificultar la posterior capacidad de un investigador o profesional sanitario para detectar los componentes celulares internos. En otras palabras, lo que evita exactamente la degradación de la célula, la fijación, también puede ser un obstáculo a los muchos tipos de investigación y diagnóstico que se basan en moléculas de detección de mayor tamaño. Debido a esto, se han hecho esfuerzos por permeabilizar células o crear canales tras la fijación. Los procedimientos actuales de permeabilización de la membrana celular tras la fijación no son eficaces para todos los especímenes, son demasiado rigurosos (por tanto, destruyen las estructuras objeto de estudio) y/o requieren un equipo caro. Por ejemplo, Hoffman, et al., (patente estadounidense n.º 6.835.393) revelan el uso de polímeros de ácido policarboxílico y del pH para afectar a las membranas celulares sólo para su uso en muestras no fijadas. Connelly, et al., (patentes estadounidenses n.º 5.597.688 y 5.422.277) revelan el uso de una composición con ácido 2,4dinitrobencenosulfónico, ácido 2,4dinitrobenzoico o 2,4dinitrofenol, tanto para la fijación de la membrana celular como la permeabilización, pero estas composiciones limitan la elección que el investigador o el profesional sanitario ha hacer sobre el fijador y, por tanto, limita la necesaria flexibilidad del análisis. Los procedimientos mecánicos, tales como el tratamiento de ultrasonidos, la electroporación, etc., habitualmente, sólo funcionan en muestras no fijadas y requieren un equipo caro. Además, los procedimientos disponibles de investigación y diagnóstico de la técnica anterior para muchas dianas celulares, tales como patologías, dependen de evaluaciones microscópicas, parámetros morfológicos celulares, características de tinción y la presencia o ausencia de ciertas dianas. Sin embargo, muchos de estos procedimientos de diagnóstico no son completamente exactos ni lo suficientemente sensibles. Lo que se necesita son composiciones y procedimientos para mejorar la permeabilidad de membranas celulares de especímenes hacia partículas foráneas, tales como moléculas de detección marcadas. Además, lo que se necesita son composiciones y procedimientos para mejorar la detección de dianas celulares y patógenos. Resumen de la invención En una realización, la invención permite la detección de la diana o del fragmento de diana, directamente en células de un cultivo celular o espécimen obtenido de un paciente, mediante hibridación in situ. En una realización preferida, la célula es un patógeno. El procedimiento se compone de varias etapas que se realizan, preferiblemente, pero no necesariamente, en el orden enumerado. Se deposita una muestra de cultivo o espécimen sobre un portaobjetos. Se fija la muestra sobre el portaobjetos bien mediante calor o con un fijador estándar. El fijador puede ser, por ejemplo, metanol, ácido acético de metanol, acetona, formaldehído o formalina. Se trata la muestra fijada con las soluciones de IDF (véase debajo), teñidas o sondadas, y se observa. Alternativamente, se mezcla el espécimen con solución de IDF, se incuba, luego se prepara en forma de frotis o se coloca de otro modo en un portaobjetos de vidrio, se seca al aire y se fija. La solución de IDF puede comprender cualquier combinación de los 2 E06788834 23-11-2011   siguientes reactivos: sales caotrópicas (p.ej., tiosulfato o clorhidrato de guanidina), detergentes iónicos (p.ej., SDS) y/o detergentes no iónicos (p.ej., IPGEL, desoxicolato, colato o sales biliares) u otros reactivos con propiedades similares, metanol y ácido acético. La concentración de cada reactivo en la solución de IDF depende, por ejemplo, de la pared celular del patógeno que se vaya a detectar. Aunque la presente invención no está limitada por ninguna teoría ni mecanismo, se cree que la solución de IDF crea canales en la pared y/o membranas celulares (celulares o nucleares) del patógeno. Estos canales permiten a una sonda penetrar por la pared celular y la membrana celular, y entrar en el citoplasma y/o el núcleo del patógeno. La sonda de la presente invención puede comprender ADN, ARN, ANP, péptido, glucopéptido, lipoproteína o glucolípido o una mezcla de cualquiera de los anteriores. Las dianas de las células fijadas en la muestra entran en contacto con un complejo sonda (el complejo sonda comprende los agentes de unión específicos de la diana) específico de la diana en condiciones apropiadas para la hibridación o la unión (por ejemplo, según lo descrito en la patente estadounidense n.º 6.165.723 concedida a Shah y Harris). Luego, se puede aclarar la sonda no hibridada o no unida de la muestra. En una realización, después es posible teñir la muestra aclarada con un colorante de contraste apropiado (p.ej., azul de Evans, DAPI, permanganato de potasio, etc). El complejo sonda hibridado o unido se detecta visualmente, por ejemplo, a través de microscopio, siendo la presencia del complejo sonda un indicador de la presencia de la diana celular. El procedimiento se puede realizar con diferentes tampones de hibridación, siendo varios ejemplos revelados en la presente memoria y en la patente estadounidense n.º 6.165.723 concedida a Shah y Harris, que se incorpora en la presente memoria por referencia). El tampón de hibridación usado se determina por la naturaleza de la sonda usada. El procedimiento de la presente invención es útil para detectar células, constituyentes celulares y, preferiblemente, patógenos en un espécimen. A modo de ejemplo, en la presente memoria, se revelan complejos de sonda específicos que son útiles para detectar patógenos de las especies del género Mycobacterium. Los procedimientos de la presente invención son útiles, por ejemplo, en la detección de ácidos nucleicos, péptidos, glucopéptidos, lipopéptidos y glucolípidos de una amplia variedad de especímenes. Los especímenes ejemplares incluyen, por ejemplo, células, tipos de células, tejidos o un patógeno o patógenos de interés que incluyen o proceden de, p.ej., suero, plasma, esputo, orina, líquidos cerebroespinales, tejidos y leche materna. Las composiciones y los procedimientos de la presente invención se pueden usar en especímenes de cualquier organismo, incluyendo mamíferos, reptiles, peces, aves, plantas e insectos. En una realización, la presente invención contempla una composición (solución de IDF) para aumentar la permeabilidad de paredes celulares, membranas celulares, membranas de orgánulos y membranas nucleares, composición que comprende en una realización: GuSCN (tiocianato de guanidina), TrisHCl, EDTA, IGEPAL (octilfenoxipoli(etilenoxi)etanol), ácido acético, metanol, colato de sodio y desoxicolato de sodio. La presente invención contempla además que el GuSCN está a una concentración de aproximadamente 2,0 a 3,3M; el TrisHCl está a una concentración de aproximadamente 10 a 100mM; el TrisHCl está a un pH de... [Seguir leyendo]

1. Una composición para aumentar la permeabilidad de paredes celulares, membranas celulares y membranas nucleares, composición que comprende: GuSCN (tiocianato de guanidina), TrisHCl, EDTA, IGEPAL (octilfenoxipoli(etilenoxi)etanol), ácido acético, metanol, colato de sodio y desoxicolato de sodio. 2. La composición de la reivindicación 1, en la que: a) dicho GuSCN está a una concentración de aproximadamente 2,0 a 3,3M; y/o b) dicho TrisHCl está a una concentración de aproximadamente 10 a 100mM; y/o c) dicho TrisHCl está a un pH de aproximadamente 7,0 a 9,0; y/o d) dicho EDTA está a una concentración de aproximadamente 5 a 50mM; y/o e) dicho IGEPAL está a una concentración del aproximadamente 0,1 al 2,0 por ciento; y/o f) dicho ácido acético está a una concentración del aproximadamente 1,0 al 10 por ciento; y/o g) dicho metanol está a una concentración del aproximadamente 20 al 50 por ciento; y/o h) dicho colato de sodio está a una concentración del aproximadamente 0,02 al 2,5 por ciento; y/o i) dicho desoxicolato de sodio está a una concentración del aproximadamente 0,02 al 2,5 por ciento. 3. Un procedimiento para teñir una diana en una célula que comprende: a) poner en contacto la célula con una composición que comprende GuSCN (tiocianato de guanidina), Tris HCl, EDTA, IGEPAL (octilfenoxipoli(etilenoxi)etanol), ácido acético, metanol, colato de sodio y desoxicolato de sodio para crear una célula permeabilizada; b) poner en contacto la célula permeabilizada de la etapa (a) con un agente de unión específico de la unión con dicha diana; y c) detectar dicho agente de unión de la etapa (b). 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha diana se selecciona de un grupo que consiste en ácidos nucleicos, ácidos nucleicos de péptidos, péptidos, glucoproteínas, lípidos, lipoproteinas, virus y priones. 5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho agente de unión se selecciona de un grupo que consiste en ácidos nucleicos, ácidos nucleicos de péptidos, péptidos, lipoproteínas, glucoproteínas y lípidos; y/o dicho agente de unión comprende además un resto de detección; y en cuyo caso, opcionalmente, en el que el resto de detección se selecciona de un grupo que consiste en marcadores fluorescentes, marcadores radiactivos, tintes, metales coloidales, biotina/avidina y peroxidasa de rábano picante. 6. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha detección se realiza mediante un anticuerpo marcado con afinidad por dicho agente de unión. 7. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la composición comprende la composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2. 8. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha diana es un ácido nucleico del microorganismo Mycobacterium tuberculosis. 9. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho agente de unión es un oligonucleótido complementario a un ácido nucleico del microorganismo Mycobacterium tuberculosis. 10. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho procedimiento comprende además la tinción del fondo. E06788834 23-11-2011