Mejora de títulos de polipéptido de factor VIII en cultivos celulares.

Método para la producción de un polipéptido de factor VIII, comprendiendo el método las fases de

a) cultivo de una célula de mamífero expresando un polipéptido de factor VIII en condiciones de expresión de dicho polipéptido de factor VIII,

comportando dichas condiciones de cultivo un medio de cultivo celular comprendiendo O-fosfo-L-serina (OPLS), y

b) aislamiento del polipéptido de factor VIII expresado a partir de la célula de mamífero mediante medios adecuados

Mejora de títulos de polipéptido de factor VIII en cultivos celulares.

La presente invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido de factor VIII el cual implica el uso del enlace del dominio C2, O-fosfo-L-serina (OPLS) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La hemofilia clásica o hemofilia A es un trastorno de sangrado hereditario. Es resultado de una deficiencia del factor VIII de coagulación sanguínea ligada al cromosoma X y afecta a los hombres casi de forma exclusiva, con una incidencia de entre uno y dos individuos por cada 10, 000. El defecto del cromosoma X es transmitido por portadores hembra, los cuales mismos no son hemofílicos. La manifestación clínica de la hemofilia A es una tendencia al sangrado aumentada. Antes de que se introdujera el tratamiento con concentrados de factor VIII, la esperanza de vida media de una persona con una hemofilia severa se estimaba inferior a 20 años. El uso de concentrados de factor VIII de plasma ha mejorado considerablemente la situación de los pacientes con hemofilia, prolongando con ello su esperanza de vida, dando a la mayoría de ellos la posibilidad de vivir una vida más o menos normal. No obstante, han habido ciertos problemas con los concentrados derivados de plasma y su uso, el más serio de los cuales ha sido la transmisión de virus. Hasta el momento, virus que causan SIDA, hepatitis B, y hepatitis no-A no-B han asestado un serio golpe a la población. Dado que se han ido desarrollando diferentes métodos de desactivación de virus y nuevos concentrados altamente purificados de factor VIII, lo cual establece un estándar de seguridad muy alto también para el factor VIII derivado de plasma.

El factor VIII (FVIII) se sabe que se expresa a niveles muy bajos en las células de mamífero. También se sabe que el factor VIII es una proteína inestable en medios libres de suero o libres de proteína. Se ha usado la adición de varias sustancias para mejorar la estabilidad y títulos del factor VIII.

El documento WO 9743436 divulga la adición de inhibidores de inhibidores dependientes de metal y/o quimiotripsinas.

El documento WO 88/08035 y el documento WO 87/04187 divulga la adición de fosfolípidos al medio de cultivo de factor VIII. También se describe la coexpresión del factor de von Willebrand (vWF) .

El documento US 2005 0227913 A1 divulga OPLS como un inhibidor de agregación de factor VIII por unión al dominio C2 (2303-2332) . El factor VIII menos agregado se reivindica como menos inmunogénico.

K. Hansen, M. Kjalke, P.B. Rasmussen, L. Kongerslev, y M. Ezban, Cytotechcnol. 24 (3) , 227-234, 1997, divulgan el uso de bacitracina A y de fosfatidilserina para prevenir la degradación del factor VIII en medio.

El documento WO 90/02175 A1 divulga procesos de producción de polipéptido (s) recombinantes mediante el cultivo de células eucariotas en presencia de inhibidores de proteasa para prevenir la degradación de los polipéptido (s) .

El documento EP 1707634 A1 divulga que grandes cantidades de factor VIII se asocian con la superficie celular y pueden ser eliminados por el lavado con tampones de alta fuerza iónica.

Siendo esto así, todavía hay una necesidad de métodos de producción mejorados para mejorar el rendimiento general de los polipéptidos de factor VIII y/o reducir los costes de producción.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Un primer aspecto de la invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido de factor VIII, comprendiendo el método las fases de a) cultivo de una de célula expresando un polipéptido de factor VIII en condiciones para la expresión de dicho polipéptido de factor VIII, implicando dichas condiciones de cultivo un medio de cultivo celular comprendiendo O-fosfo-L-serina (OPLS) , y b) aislamiento del polipéptido de factor VIII expresado a partir de la célula de mamífero mediante un medio adecuado.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido de factor VIII, comprendiendo el método las fases a) cultivo de una célula de mamífero que expresa un polipéptido de factor VIII en condiciones para la expresión de dicho polipéptido de factor VIII, implicando dichas condiciones de cultivo un medio de cultivo celular, y b) aislamiento del polipéptido de factor VIII expresado de la célula de mamífero con medios adecuados, implicando dichos medios la adición de O-fosfo-L-serina (OPLS) a dichas células.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Secuencia de gen del factor VIII (ADNc) (SEC ID n.º 1) .

Figura 2A-B: efecto de la O-fosfo-L-serina en la productividad de FVIII y en la actividad específica de la proteína FVIII.

Figura 3A-C. Efecto de la O-fosfo-L-serina y/o de un hidrolizado proteico de planta sobre en el factor VIII en el medio de células de producción de factor VIII. La tabla 4 muestra la identidad de las condiciones A-D.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Como se ha mencionado anteriormente, un primer aspecto de la invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido de factor VIII, comprendiendo el método las fases a) cultivo de una célula de mamífero que expresa un polipéptido de factor VIII en condiciones de expresión para dicho polipéptido de factor VIII, implicando dichas condiciones de cultivo un medio de cultivo celular comprendiendo O-fosfo-L-serina (OPLS) , y b) aislamiento del polipéptido de factor VIII expresado de la célula de mamífero mediante medios adecuados.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido de factor VIII, comprendiendo el método las fases a) cultivo de una célula de mamífero que expresa un polipéptido de factor VIII en condiciones de expresión para dicho polipéptido de factor VIII, implicando dichas condiciones de cultivo un medio de cultivo celular, y b) aislamiento del polipéptido de factor VIII expresado de la célula de mamífero mediante medios adecuados, implicando dichos medios adecuados la adición de O-fosfo-L-serina (OPLS) a dichas células.

En ambos ejemplos, la OPLS desempeña un papel importante facilitando un aumento de los niveles de titulación del polipéptido de factor VIII en el medio de cultivo celular.

Sin atenerse a ninguna teoría en particular, se cree que el aumento de los niveles de titulación de los polipéptidos de factor VIII en el medio de cultivo celular es ocasionado por el enlace de dominio C2 (en particular O-fosfo-L-serina (OPLS) ) que, bien sola o en combinación con un inhibidor de tripsina de semilla de soja (SBTI) y/o un hidrolizado proteico de planta, bien (i) aumenta la cantidad de polipéptido de factor VIII secretada por las células, y/o (ii) compite polipéptido de factor VIII unido a la célula fuera de las células, y/o (iii) disminuye la degradación del polipéptido de factor VIII, aumentando con ello la cantidad de polipéptido funcional de factor VIII presente en el sobrenadante.

A continuación se describe la invención con más detalle.

El enlace de dominio C2 es un enlace capaz de unirse a o ser unido al dominio C2 (ver abajo) del polipéptido de factor VIII. Preferiblemente, el enlace de dominio C2 debería ser capaz de desplazar (sin competir) al polipéptido de factor VIII de la membrana celular.

En la forma de realización actualmente más preferida, el enlace de dominio C2 es O-fosfo-L-serina (OPLS) , es decir, una molécula de la fórmula (HO) 2 P (O) OCH2CH (NH2) CO2H.

Se cree que una alternativa adecuada para los enlaces de dominio C2 sería cualquiera con la fórmula (XO) (HO) P (O) OCH2CH (NH2) CO2H, en la que se selecciona X se selecciona a partir de alquilo-C1-6 opcionalmente sustituido, de alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, fenilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, y bencilo opcionalmente sustituido. En una forma de realización de la misma, X se selecciona de un alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, de bencilo opcionalmente sustituido, y de alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido.

En el presente contexto, el término "alquilo C1-6" denomina un grupo de hidrocarburos lineal, cíclico o ramificado con de 1 a 6 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, pentilo, ciclopentilo, hexilo, ciclohexilo.

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1. Método para la producción de un polipéptido de factor VIII, comprendiendo el método las fases de a) cultivo de una célula de mamífero expresando un polipéptido de factor VIII en condiciones de expresión de dicho polipéptido de factor VIII, comportando dichas condiciones de cultivo un medio de cultivo celular comprendiendo O-fosfo-L-serina (OPLS) , y b) aislamiento del polipéptido de factor VIII expresado a partir de la célula de mamífero mediante medios adecuados.

2. Método para la producción de un polipéptido de factor VIII, comprendiendo el método las fases de a) cultivo de una célula de mamífero expresando un polipéptido de factor VIII en condiciones de expresión de dicho polipéptido de factor VIII, comportando dichas condiciones de cultivo un medio de cultivo celular, y b) aislamiento del polipéptido de factor VIII expresado a partir de la célula de mamífero mediante medios adecuados, comportando dichos medios adecuados la adición de O-fosfo-L-serina (OPLS) a dichas células.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la OPLS está presente en el medio de cultivo celular en una concentración de 0.1-100 mM.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la OPLS se añade a las células en la fase b) en una concentración de 1-200 mM.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de cultivo celular comprende además un inhibidor de tripsina de semilla de soja.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de cultivo celular comprende además un hidrolizado de proteína vegetal.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula de mamífero se selecciona del grupo consistente en células de mamífero que expresan endógenamente el polipéptido de factor VIII y células de mamífero que han sido transfeccionadas con un gen para el polipéptido de factor VIII.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula de mamífero ha sido transfeccionada con un vector de expresión comprendiendo una molécula de ácido nucleico codificando el polipéptido de factor VIII y regiones de control de expresión operativamente unidas a este.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de cultivo celular está esencialmente libre de suero.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polipéptido de factor VIII se recoge a partir del medio de cultivo celular sustancialmente sin reducción de la viabilidad de las células.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la producción se continúa utilizando el mismo lote de células.

Secuencia genética del factor VIII (ADNc) (SEC. ID nº 1)

FIGURA 1