Medios de ensayo y procedimiento de identificación y diferenciación de bacterias.

Medio de ensayo para detectar, cuantificar o diferenciar organismos coliformes generales,

E. coli, Aeromonas y Salmonella, comprendiendo dicho medio de ensayo:

un sustrato cromogeno o no cromogeno de -D-glucuronido, que forma un primer producto que es visible a la luz ambiental en presencia de E. coli; un sustrato cromogeno de α-D-galactosido, que forma un segundo producto que es visible a la luz ambiental en presencia de Salmonella, E. coli y otros organismos coliformes; y un sustrato cromogeno de β-D-galactosido, que forma un tercer producto que es visible a la luz ambiental en presencia de Aeromonas, E. coli y otros organismos coliformes, formando tales productos de sustratos de dicho α-D-galactosido y de dicho β-D-galactosido una combinacion de color en presencia de coliformes generales y E. coli y en el que todos los coliformes generales, E. coli, Aeromonas y Salmonella, se distinguibles unos de otros, y un cuarto sustrato, a saber un sustrato de α-D-galactosido o un sustrato de β-D-galactosido, que forma un producto que produce fluorescencia a la luz ultravioleta en presencia de al menos uno de entre E. coli, coliformes generales, Salmonella oo Aeromonas.

Medios de ensayo y procedimiento de identificacion y diferenciacion de bacterias Antecedentes de la invención La presente invencion se refiere a un medio de ensayo y al procedimiento de deteccion, cuantificacion, identificacion y/o diferenciacion de materiales biologicos en una muestra, que puede contener diversos materiales biologicos diferentes. El medio de ensayo es adecuado para detectar, cuantificar o diferenciar coliformes generales, E. coli, Aeromonas y Salmonella.

Las bacterias son el factor etiologico en muchas enfermedades de personas, animales superiores y plantas, y generalmente se transmiten por vehiculos tales como el agua, las bebidas, los alimentos y otros organismos. La experimentacion de estos vehiculos potenciales de bacterias es de importancia clinica y generalmente se basa en "organismos indicadores". Borrego et al., Microbiol. Sem. 13:413-426, (1998) . Por ejemplo, Escherichia coli (E. coli) es un miembro gram negativo de la familia de las Enterobacteriaceae que es parte de la flora intestinal normal de los animales de sangre caliente, y su presencia indica contaminacion fecal (p. ej., aguas residuales sin depurar) . Aun cuando la mayoria de las cepas de E. coli no son la causa real de la enfermedad, su presencia es una potente indicacion de la posible presencia de patogenos asociados a la enfermedad intestinal, tales como el colera, la disenteria y la hepatitis, entre otras. Por consiguiente, E. coli ha llegado a ser un organismo indicador primario para la contaminacion fecal, y como resultado, cualquier procedimiento que diferencie e identifique E. coli de otras bacterias es muy util.

Otros miembros de la familia de las Enterobacteriaceae, denominadas normalmente "coliformes generales", especialmente el genero "Citrobacter", Enterobacter y Klebsiella, se consideran tambien que son organismos indicadores significativos para la calidad del agua, las bebidas y los alimentos. Por lo tanto, las pruebas para identificar y diferenciar coliformes generales de E. coli son tambien muy utiles. Ademas, se ha demostrado que varias especies del genero Aeromonas no solamente son patogenos potenciales, sino que tienen una correlacion con otros organismos indicadores (Petibone et al., J. Appl. Microbiol.. 85:723-730 (1998) ) . Los procedimientos de ensayo actuales para identificar, separar y enumerar Aeromonas spp. de las Enterobacteriaceae muy similares han faltado y la mayoria de los procedimientos actuales que usan sustratos enzimaticos no separan Aeromonas spp. de Enterobacteriaceae debido a sus caracteristicas bioquimicas casi identicas. Cualquier procedimiento que dependa de la identificacion de los coliformes generales por medio de un sustrato de º-galactosidasa no diferencia las Aeromonas spp. de los coliformes generales o elimina las Aeromonas de la muestra mediante el uso de inhibidores especificos (antibiotico tal como cefsulodina) . Brenner et al., Appl. Envir. Microbio. 59:3534-44 (1993) . No diferencian, ni identifican ni enumeran Aeromonas junto con E. coli y coliformes generales. Landre et al., Letters Appl. Microbiol. 26:352-354 (1998) . Son necesarios procedimientos de ensayo mejorados para identificar, separar y enumerar eficazmente dichos tipos bacterianos, y hay una investigacion continua para usar de manera mas rapida, mas precisa, mas facil y mas versatil procedimientos de ensayo y aparatos en este campo.

Se han usado numerosos procedimientos de ensayo para determinar, identificar y enumerar uno o mas organismos indicadores. Algunos de estos procedimientos de ensayo solamente indican la presencia o ausencia del microorganismo, mientras que otros intentan ademas cuantificar uno o mas de los organismos especificos en esta muestra de ensayo. Por ejemplo, un ensayo cualitativo denominado ensayo de presencia/ausencia (o P/A) , puede usarse para determinar la presencia o ausencia de coliformes y E. coli en la muestra de ensayo. Un medio de ensayo que incluye el sustrato de º-galactosidasa O-nitrofenil-º-D-galactopiranosido (ONPG) , y el sustrato de º-glucuronidasa-metil-umbeliferil-º-D-glucuronido (MUG) , se inocula con la muestra de ensayo. Para diferenciar los coliformes generales de E. coli, este ensayo se basa en el hecho de que generalmente todos los coliformes producen º-galactosidasa, mientras que solamente E. coli produce ademas º-glucuronidasa ademas de ºgalactosidasa. Si estan presente algunos coliformes (incluyendo E. coli) , el caldo de cultivo se vuelve de color 45 amarillo debido a la actividad de la enzima galactosidasa en el material ONPG que produce la liberacion de un pigmento amarillo difundible. Si esta presente E. coli, el caldo de cultivo presentara una fluorescencia azul cuando se irradie con rayos ultravioleta, debido a la rotura del reactivo MUG con liberacion del colorante fuorogeno originado por la produccion de la enzima glucuronidasa. Estas reacciones son muy especificas, y permiten la presencia de coliformes del caldo de cultivo en general, asi como que se identifique E. coli en una sola muestra. Un inconveniente 50 de este ensayo es que no es directamente cuantitativo para uno de los dos tipos de bacterias, ya que ambos reactivos producen pigmentos difundibles. Un segundo inconveniente es que puede haber una reaccion de coliforme de falso positivo si estan presentes Aeromonas spp. en la muestra de ensayo. Esto se ha demostrado que es posible aun cuando existan inhibidores presentes para impedir que ocurra esto supuestamente (Landre et al., Letters Appl. Microbiol. 26:352-354 (1998) ) . El ensayo tambien requiere equipo especifico para producir los rayos ultravioletas.

55 Ademas, este ensayo puede usarse solamente para detectar coliformes y E. coli. Otros organismos importante tales como, la cepa 0157 de E. coli que es negativa a glucuronidasa, no se detectan, ni son otros microorganismos que no producen ni galactosidasa ni glucuronidasa.

Se ha usado el procedimiento de Violeta Rojo Bilis Agar-agar (VRBA) para determinar la cantidad tanto de coliformes como de E. coli en una muestra de ensayo. El medio de ensayo usado en este procedimiento incluye 60 sales biliares (para inhibir no coliformes) , lactosa y el indicador de pH rojo neutro. Como coliformes (incluyendo E.

coli) desarrollados en el medio, la lactosa se fermenta con produccion de acido, y el rojo neutro en el aire de la colonia bacteriana se vuelve de color rojo ladrillo. Los resultados de este ensayo no son siempre faciles de interpretar, y con objeto de determinar la presencia de E. coli, que confirma los ensayos siguientes, tal como la fermentacion en caldo de lactosa verde brillante, debe realizarse el cultivo en caldo de cultivo EC a 44, 5 DC y usando una tira de Eosina Azul de Metileno Agar-agar (EMBA) .

El procedimiento del filtro de membrana (FM) usa filtros de microporos a traves de los cuales se pasan las muestras de modo que las bacterias son retenidas en la superficie del filtro. Este procedimiento se usa muy a menudo cuando las poblaciones bacterianas son muy pequenas, y se necesita una muestra grande para obtener cifras adecuadas. El filtro se coloca a continuacion en la superficie de un medio seleccionado, se incuba y las colonias bacterianas que se desarrollan en la superficie del filtro de membrana se cuentan y evaluan. Este procedimiento se usa extensamente y proporciona buenos resultados cuando se combina con reactivos y medios apropiados. Un inconveniente de este procedimiento es que es costoso y largo. Ademas no opera bien con muestras solidas, o muestras con recuentos elevados de particulas. El procedimiento FM puede usarse junto con el procedimiento de la invencion descrito en la presente solicitud.

El procedimiento m-Endo se usa tambien para determinar la cantidad de E. coli y coliformes generales y es un procedimiento oficial aprobado por la USEPA para analizar la calidad del agua. El medio se usa normalmente con un filtro de membrana y E. coli y unidades formadoras de colonias de coliformes generales (UFC) se desarrollan como colonias oscuras con un brillo metalico verde dorado. Debido a una elevada cantidad probada de error por falso positivo, las colonias tipicas deben confirmarse por analisis adicional. Standard Methods for the Examination of mater and Wastewater, 20a Edicion, 9-10 y 9-60 (1998) .

Otros ensayos, tales como el Numero Mas Probable (NMP) usan caldos de cultivo que contienen lactosa (LST, BGLB, EC) para estimar los numeros de coliformes generales y E. coli, pero se ha demostrado tambien que tienen altas proporciones de error asi como que son problematicas y lentas para producir resultados. Evans et al., Appl. Envir. Microbiol. 41:130-138 (1981) .

El reactivo 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiranosido (X-gal) es un conocido compuesto de ensayo para identificar... [Seguir leyendo]

1. Medio de ensayo para detectar, cuantificar o diferenciar organismos coliformes generales, E. coli, Aeromonas y Salmonella, comprendiendo dicho medio de ensayo:

un sustrato cromogeno o no cromogeno de -D-glucuronido, que forma un primer producto que es visible a la luz ambiental en presencia de E. coli; un sustrato cromogeno de a-D-galactosido, que forma un segundo producto que es visible a la luz ambiental en presencia de Salmonella, E. coli y otros organismos coliformes; y un sustrato cromogeno de -D-galactosido, que forma un tercer producto que es visible a la luz ambiental en presencia de Aeromonas, E. coli y otros organismos coliformes, formando tales productos de sustratos de dicho a-D-galactosido y de dicho -D-galactosido una combinacion de color en presencia de coliformes generales y E. coli y en el que todos los coliformes generales, E. coli, Aeromonas y Salmonella, se distinguibles unos de otros, y un cuarto sustrato, a saber un sustrato de a-D-galactosido o un sustrato de -D-galactosido, que forma un producto que produce fluorescencia a la luz ultravioleta en presencia de al menos uno de entre E. coli, coliformes generales, Salmonella oo Aeromonas.

2. El medio de ensayo como se expone en la reivindicacion 1, en el que dicho cuarto sustrato es un sustrato de a-Dgalactosido, y el producto del cuarto sustrato formado en presencia de E. coli, de coliformes generales y/o de Salmonella produce fluorescencia a la luz ultravioleta.

3. El medio de ensayo como se expone en la reivindicacion 1, en el que dicho cuarto sustrato es un sustrato de -Dgalactosido, y el producto se forma en presencia de E. coli, coliformes generales y/o Aeromonas produce fluorescencia a la luz ultravioleta.

4. El medio de ensayo como se expone en la reivindicacion 1, en el que dicho sustrato cromogeno o no cromogeno de -D-glucuronido produce color y uno de entre dicho sustrato cromogeno de a-D-galactosido o dicho sustrato cromogeno para -D-galactosido incluye el mismo componente de color que dicho sustrato de -D-glucuronido cromogeno o no cromogeno.

5. El medio de ensayo como se expone en la reivindicacion 4, en el que dicho sustrato cromogeno o no cromogeno y dicho sustrato cromogeno de a-D-galactosido o dicho sustrato cromogeno de -D-galactosido estan presentes en cantidades iguales.

6. El medio de ensayo de la reivindicacion 4, en el que dicho sustrato de -D-glucuronido y uno o el otro de entre dicho sustrato cromogeno de a-D-galactosido o de dicho sustrato cromogeno de -D-galactosido estan presentes en cantidades diferentes.

7. El medio de ensayo de la reivindicacion 6, en el que hay mas de dicho sustrato de -D-glucuronido que de dicho sustrato cromogeno de a-D-galactosido o de dicho sustrato cromogeno de -D-galactosido del mismo componente de color.

8. El medio de ensayo de la reivindicacion 1, en el que dicho cuarto sustrato incluye el componente fluorescente, 4metilumbeliferilo.

9. El medio de ensayo de la reivindicacion 6, en el que el producto de dicho sustrato de -D-glucuronido formado en presencia de E. coli aparece mas oscuro que el producto formado en presencia tanto de Salmonella como de Aeromonas que se forma del mismo componente cromogeno.

10. El medio de ensayo como se expone en la reivindicacion 1, en el que dicho medio ofrece una doble verificacion de la presencia de E. coli, en la que dicha primera verificacion es la fluorescencia de E. coli a la luz ultravioleta y la segunda verificacion es una identificacion a simple vista a la luz ambiental de un producto de sustrato cromogeno o no cromogeno.

11. El medio de ensayo como se expone en la reivindicacion 10, en el que dicha verificacion de E. coli al producir fluorescencia a la luz ultravioleta es detectable antes de identificacion visible del sustrato cromogeno o no cromogeno.

12. El medio de ensayo como se expone en la reivindicacion 1, en el que dicho sustrato de a-D-galactosido cromogeno es 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosido y el producto formado en presencia de coliformes totales es de color cerceta, y un producto de color cerceta se forma tambien en presencia de Salmonella.

13. El medio de ensayo como se expone en la reivindicacion 1, en el que dicho sustrato de -D-galactosido cromogeno es 5-bromo-4-cloro-3-indolil-º-D-galactopiranosido, y el producto formado en presencia de los coliformes totales es de color cerceta, y un producto de color cerceta se forma tambien en presencia de Aeromonas.

14. El medio de ensayo como se expone en la reivindicacion 1, en el que dicho sustrato de -D-glucuronido es el 5bromo-4-cloro-3-indolil-º-D-glucuronido.