Un polipéptido aislado que tiene actividad de flujo de salida de colesterol y actividad de estabilización de ABCA1,

en el que el polipéptido comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos siguiente: X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24 (SEC ID Nº : 11) en la que: X1, X7, X8, X15, X18 y X19 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en E y D; X2, X6, X9, X10, X12 X13, X16, X17, X20, X21 y X24 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en A, V, L, I, F, W, M y P; X3, X5, X14 y X23 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en R, K, A, V, L, 1, F, W, M, P, G, S, T, C, Y, N y Q, en la que al menos dos de X3, X5, X14 y X23 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en R y K; y X4, X11 y X22 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en S, T, G, A e Y; en la que cuando está presente una prolina, está presente en una sola posición; o

(b) la variante de la SEC ID Nº : 4, 5, 6 ó 7 que está sustituida con restos aminoacídicos conservativos y tiene una identidad de al menos el 75%, al menos el 85% o al menos el 90% con EVRSKLEEWFAAFREFAEEFLARLKS (SEC ID Nº : 4), EVRSKLEEWFAAFREFFEEFLARLKS (SEC ID Nº : 5), EFRSKLEEWFAAFREFFEEFLARLKS (SEC ID Nº : 6); o EFRSKLEEWFAAFREFAEEFLARLKS (SEC ID Nº : 7); en la que cuando está presente una prolina, está presente en una sola posición.

Mediadores selectivos y potentes del flujo de salida de colesterol Esta invención se realizó con financiación del gobierno bajo el Nº de Contrato DE-AC02-05CH11231 concedido por el Departamento de Energía de los Estados Unidos y la Subvención (Contrato) Nº R03-AG023153 concedida por el Instituto Nacional del Envejecimiento. El Gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

La investigación que condujo a esta invención también estaba financiada por un acuerdo de investigación patrocinado con Arter y Therapeutics, Inc. (LBNL Work for Other Agreement No. LB05-001119) y por la Subvención Nº 13IT-0025 concedida por el Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco del Estado de California.

Antecedentes de la invención

La enfermedad cardiovascular (CVD) es una causa principal de morbilidad y mortalidad en los Estados Unidos y en todo el mundo. La acumulación de colesterol en macrófagos en la pared arterial promueve la formación de células espumosas y aterosclerosis, constituyendo una causa principal de CVD (Schmitz, G. y Kaminski, W. E., “ATPbinding cassette (ABC) transporters in aterosclerosis”, Curr Atheroscler Rep., 4 (3) : 243-51 (2002) . La acumulación de colesterol en macrófagos depende en gran medida del equilibrio entre la deposición por partículas lipoproteicas que contienen Apolipoproteína B, tales como VLDL, IDL y LDL, y la eliminación de colesterol por partículas ApoA-l y ApoE. La disminución de las concentraciones de LDL en plasma por estatinas y otras medicaciones de disminución de los niveles de colesterol previene aproximadamente un tercio de los acontecimientos de CVD, aunque continúan existiendo dos tercios de los acontecimientos (véase, por ejemplo, “Randomized trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronar y heart disease: the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S) , Lancet, 344 (8934) : 13831389 (1994) ; y “Influence of pravastatin and plasma lipids on clinical events in the West of Scotland Coronar y Prevention Study (WOSCOPS) , Circulation, 197 (15) : 1440-5 (1998) . Esto último constituye una enorme necesidad médica sin satisfacer.

Niveles elevados de colesterol HDL en plasma están asociados con un riesgo reducido de aterosclerosis (Gordon et al., “High Density Lipoprotein As A Protective Factor Against Coronar y Heart Disease”, Am. J. Med., 62: 707-14 (1977) ) . Estudios epidemiológicos recientes han sido capaces de atribuir el efecto protector de las HDL a su apolipoproteína principal, Apo A-l (Walldius, G, et al., High Apolipoprotein B, Low Apolipoprotein A-l, And Improvement In The Prediction of Fatal Myocardial Infarction (AMORIS study) : A Prospective Study”, Lancet, 358 (9298) : 2026-33 (2001) ; y Yusuf et al., “Effect of Potentially Modifiable Risk Factors Associated With Myocardial Infarction in 52 Countries (the INTERHEART study) : Case-control Study”, Lancet, 364 (9438) : 937-52 (2004) ) . Los efectos beneficiosos de las HDL están relacionados, en parte, con su actividad en la mediación de la ruta antiaterogénica de transporte inverso de colesterol (RCT) . El RCT implica el transporte de colesterol desde los macrófagos periféricos hasta el hígado para la excreción de esterol en heces (Lewis et al., “New Insights Into The Regulation of HDL Metabolism and Reverse Cholesterol Transport”, Circ. Res., 96: 1221-32 (2005) ) . La etapa limitante de la velocidad del RCT implica la estimulación del flujo de salida de colesterol de los macrófagos, mediada por apolipoproteínas nativas tales como Apo A-l y Apo E. Este proceso de flujo de salida de colesterol genera HDL nacientes y requiere el transportador del casete de unión a ATP A1 (ABCA1) o se desarrolla aterosclerosis (Calpe-Berdiel et al., “Direct Evidence In Vivo of Impaired. Macrophage-Specific Reverse Cholesterol Transport in ATP-Binding Cassette Transporter A1-Deficient Mice”, Biochim. Biophys. Acta., 1738 (1-3) : 6-9 (2005) . ABCA1 es la molécula defectuosa en la enfermedad de Tangiers, que se caracteriza por una deficiencia grave en HDL en plasma y una aterosclerosis prematura (Attie et al., “Pivotal Role of ABCA1 in Reverse Cholesterol Transport Influencing HDL Levels and Susceptibility to Atherosclerosis”, JLipid Res., 42 (11) : 1717-26. (2001) ) . Las apolipoproteínas A y E también estabilizan la proteína ABCA1 celular previniendo su degradación, lo que asegura altos niveles de exportación de colesterol celular y ensamblaje de HDL.

La importancia clínica de las HDL ha despertado el interés en el desarrollo de estrategias para manipular el RCT para fines terapéuticos. Los estudios de prueba de concepto exploratorios han demostrado que las inyecciones con variantes de Apo A-l de longitud completa, por ejemplo, proApoA-l, Apo A-l Milano y Apo A-l 2 tipo silvestre en complejos de fosfolípidos aumentan el RCT (Eriksson et al., Stimulation of Fecal Steroid Excretion After Infusion of Recombinant Proapolipoprotein A-l. Potential Reverse Cholesterol Transport in Humans” , Circulation, 100 (6) : 594-8 (1999) ) y provocan la regresión de la aterosclerosis coronaria (Nissen et al., “Effect of Recombinant ApoA-l Milano on Coronar y Atherosclerosis in Patients with Acute Coronar y Syndromes: A Randomized Controlled Trial, " JAMA, 290 (17) : 2292-300 (2003) ; y Tardif et al., “Effect of rHDL on Atherosclerosis-Safety and Efficacy (ERASE) Investigators”, JAMA, 297: 1675-82. Epub 26 marzo (2007) ) . Aunque la prometedora proteína ApoA-I de longitud completa tiene varios inconvenientes como agente terapéutico si se va a desarrollar en productos comerciales. Por ejemplo, la ApoA-I es una proteína larga de 243 aminoácidos que no es nada fácil de producir en las cantidades necesarias para un producto comercial. Además, las variantes de Apo A-I, tales como las variantes Milano y Paris, pueden provocar respuestas inmunológicas debido a su naturaleza extraña.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de composiciones y métodos adicionales que utilicen la potente ruta de RCT para mediar el flujo de salida de colesterol para estabilizar y provocar la regresión de las placas ateroscleróticas, es decir, para tratar la enfermedad cardiovascular. Sorprendentemente, la presente invención satisface esta necesidad, así como otras necesidades al proporcionar dichas composiciones y métodos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a péptidos que tienen efectos sobre el metabolismo de lípidos. Los lípidos son un componente estructural celular importante y proporcionan material de fuente para células fundamentales incluyendo prostaglandinas, especies oxidativas reactivas y similares. A través de rutas de señalización, los lípidos también contribuyen a la orquestación de las respuestas de citocinas, por ejemplo, a estímulos inflamatorios. Dichos efectos de lípidos están implicados en varias patologías incluyendo, pero sin limitación, la aterosclerosis y manifestaciones de enfermedades neurológicas, inflamatorias e infecciosas. Los péptidos ejercen sus efectos directamente o a través de mediadores. Los mediadores incluyen, pero sin limitación, HDL, transportadores ABC y mediadores para la oxidación y la inflamación.

En un aspecto, la invención proporciona por lo tanto una familia de polipéptidos que tienen una actividad de flujo de salida de colesterol que es comparable a, y preferentemente supera en base al peso, la de las apolipoproteínas de longitud completa (por ejemplo, Apo Al y Apo E) ; y que tienen una alta selectividad por ABAC1, que es comparable a la de las apolipoproteínas de longitud completa. Más particularmente, la presente invención proporciona una familia de polipéptidos de origen no natural que actúan como ligandos funcionales de alta afinidad por ABCA1 y que estimulan el flujo de salida de colesterol celular con aproximadamente la capacidad y la potencia de las apolipoproteínas nativas en una base por molécula. Los polipéptidos de la presente invención estimulan el flujo de salida de colesterol de macrófagos-células espumosas in vivo, promueven un aumento sostenido en la secreción de esterol fecal y reducen la gravedad de la aterosclerosis establecida en presencia de hipercolesterolemia y de una agresión dietética de alto contenido en grasa en un modelo de enfermedad de ratón deficiente en apolipoproteína E, y también previenen el desarrollo de aterosclerosis en un modelo de ratón deficiente en receptor de LDL.

Como tales, los polipéptidos de la presente invención, es decir, los polipéptidos que tienen una actividad selectiva y potente por ABCA1, pueden usarse terapéuticamente para... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que tiene actividad de flujo de salida de colesterol y actividad de estabilización de ABCA1, en el que el polipéptido comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos siguiente:

X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24 (SEC ID Nº : 11) en la que: X1, X7, X8, X15, X18 y X19 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en E y D; X2, X6, X9, X10, X12 X13, X16, X17, X20, X21 y X24 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en A, V, L, I, F, W, M y P; X3, X5, X14 y X23 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en R, K, A, V, L, 1, F, W, M, P, G, S, T, C, Y, N y Q, en la que al menos dos de X3, X5, X14 y X23 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en R y K; y X4, X11 y X22 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en S, T, G, A e Y; en la que cuando está presente una prolina, está presente en una sola posición; o

(b) la variante de la SEC ID Nº : 4, 5, 6 ó 7 que está sustituida con restos aminoacídicos conservativos y tiene una identidad de al menos el 75%, al menos el 85% o al menos el 90% con EVRSKLEEWFAAFREFAEEFLARLKS (SEC ID Nº : 4) , EVRSKLEEWFAAFREFFEEFLARLKS (SEC ID Nº : 5) , EFRSKLEEWFAAFREFFEEFLARLKS (SEC ID Nº : 6) ; o EFRSKLEEWFAAFREFAEEFLARLKS (SEC ID Nº : 7) ; en la que cuando está presente una prolina, está presente en una sola posición.

2. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 parte (a) , en el que

(a) X2, X6, X9, X10, X12, X13, X16, X17, X20, X21 y X24 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en A, V, L, F y W, o X2, X6, X9, X10, X12, X13, X16, X17, X20, X21 y X24 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en A, L, F y W; y/o

(b) al menos tres de X3, X5, X14 y X23 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en R y K, o X3, X5, X14 y X23 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en R, K, L y F, en el que al menos dos de X3, X5, X14 y X23 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en R y K; y/o

(c) X4, X11 y X22 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en S, A e Y, o X4, X11 y X22 son cada uno A.

3. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 parte (a) , en el que dicho polipéptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos siguiente:

X1X2X3SX5X6X7X8X9X10AAX13X14X15X16X17X18X19X20LAX23X24 (SEC ID Nº : 1) en la que: X1, X7, X8, X15, X18 y X19 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en E y D; X2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, V, L y W; X3, X5, X14 y X23 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en R y K; X6, X9, X10, X13, X16, X20 y X24 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en L, F y W; y X17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, A, L y W.

4. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos siguiente:

X1X2X3SX5LX7X8WFAAFX14X15FX17X18X19FLAX23L (SEC ID Nº : 2) en la que: X1, X7, X8, X15, X18 y X19 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en E y D; X2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y V; X3, X5, X14 y X23 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en R y K; y X17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y A.

5. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho polipéptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos siguiente:

EX2RSKLEEWFAAFREFX17EEFLARL (SEC ID Nº : 3) en la que: X2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y V; y X17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y A.

6. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 parte (a) o cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que comprende además X25 y X26 en el extremo carboxi terminal, en el que X25 es un aminoácido seleccionado independientemente del grupo que consiste en R, K, A, V, L, I, F, W, M, P, G, S, T, C, Y, N y Q, y X26 es un aminoácido seleccionado independientemente del grupo que consiste en S, C, T, G, A e Y, opcionalmente en el que

(a) X25 es K y X26 es S; o

(b) X25 o X26 es C.

7. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 parte (a) o cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el polipéptido

(a) tiene una identidad de al menos el 75% con EVRSKLEEWFAAFREFAEEFLARLKS (SEC ID Nº : 4) , EVRSKLEEWFAAFREFFEEFLARLKS (SEC ID Nº : 5) , EFRSKLEEWFAAFREFFEEFLARLKS (SEC ID Nº : 6) ; o EFRSKLEEWFAAFREFAEEFLARLKS (SEC ID Nº : 7) ;

(b) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº : 4, SEC ID Nº : 5, SEC ID Nº : 6 o SEC ID Nº : 7;

(c) tiene una identidad de al menos el 75%, de al menos el 85% o de al menos el 90% con EVRSKLEEWFAAFREFAEEFLARL (SEC ID Nº : 12) , EVRSKLEEWFAAFREFFEEFLARL (SEC ID Nº : 13) , EFRSKLEEWFAAFREFFEEFLARL (SEC ID Nº : 14) , o EFRSKLEEWFAAFREFAEEFLARL (SEC ID Nº : 15) ; o

(d) comprende la secuencia de aminos de la SEC ID Nº : 12, SEC ID Nº : 13, SEC ID Nº : 14 o SEC ID Nº : 15.

8. El polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido comprende además un grupo protector, opcionalmente en el que:

el grupo protector es un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en acetilo (Ac) , amida, grupos alquilo de 3 a 20 carbonos, Fmoc, t-butoxicarbonilo (Tboc) , grupo 9-fluorenoacetilo, grupo 1-fluorenocarboxílico, grupo 9-fluorenocarboxílico, grupo 9-fluorenona-1-carboxílico, benciloxicarbonilo, xantilo (Xan) , tritilo (Trt) , 4metiltritilo (Mtt) , 4-metoxitritilo (Mmt) , 4-metoxi-2, 3, 6-trimetil-bencenosulfonilo (Mtr) , mesitilen-2-sulfonilo (Mts) , 4, 4-dimetoxibenzhidrilo (Mbh) , tosilo (Tos) , 2, 2, 5, 7, 8-pentametil croman-6-sulfonilo (Pmc) , 4-metilbencilo (MeBzl) , 4-metoxibencilo (MeOBzl) , benciloxi (BzIO) , bencilo (Bzl) , benzoílo (Bz) , 3-nitro-2-piridinosulfonilo (Npys) , 1- (4, 4-dimetil-2, 6-dioxociclohexiliden) etilo (Dde) , 2, 6-diclorobencilo (2, 6-DiCl-Bzl) , 2clorobenciloxicarbonilo (2-CI-Z) , 2-bromobenciloxicarbonilo (2-Br-Z) , benciloximetilo (Bom) , ciclohexiloxi (cHxO) , t-butoximetilo (Bum) , t-butoxi (tBuO) , t-butilo (tBu) y trifluoroacetilo (TFA) ; y, opcionalmente, en el que

(a) el grupo protector está acoplado con el extremo amino o carboxi terminal;

(b) el polipéptido comprende un primer grupo protector acoplado al extremo amino terminal y un segundo grupo protector acoplado al extremo carboxilo terminal;

(c) el polipéptido comprende un primer grupo protector acoplado al extremo amino terminal y un segundo grupo protector acoplado al extremo carboxilo terminal, en el que dicho primer grupo protector es un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en acetilo, propionilo y un alquilo de 3 a20 carbonos;

(d) el polipéptido comprende un primer grupo protector acoplado al extremo amino terminal y un segundo grupo protector acoplado al extremo carboxilo terminal, en el que dicho primer grupo protector es un acetilo; o

(e) el polipéptido comprende un primer grupo protector acoplado al extremo amino terminal y un segundo grupo protector acoplado al extremo carboxilo terminal, en el que dicho segundo grupo protector es una amida.

9. El polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que

(a) todos los aminoácidos enantioméricos son “D” aminoácidos; o

(b) los aminoácidos enantioméricos son una mezcla de “L” aminoácidos y “D” aminoácidos.

10. El polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido

(a) protege a los fosfolípidos de la oxidación por un agente oxidante; y/o

(b) tiene actividad antiinflamatoria.

11. Un peptidomimético de un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el peptidomimético tiene actividad de flujo de salida de colesterol y actividad estabilizante de ABCA1 y el peptidomimético es el análogo retro-inverso o el análogo retro-enantio del polipéptido; o el peptidomimético incluye al menos un enlace de cadena principal que no es un enlace amida en la dirección de

amino a carboxi respecto al polipéptido de origen natural, o al menos un enlace de cadena principal que no es un enlace amida.

12. Una composición que comprende un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un peptidomimético de la reivindicación 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en el que dicha composición comprende además un agente terapéutico para tratar una enfermedad cardiovascular, tal como un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en una estatina, un agente de unión a ácidos biliares, un inhibidor de la agregación plaquetaria, nicotinamida, un activador de PPAR, vitamina E y combinaciones de los mismos.

13. Una composición que comprende un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un peptidomimético de la reivindicación 11 formando un complejo con un lípido, en el que opcionalmente dicho lípido es un fosfolípido tal como 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfatidilcolina (“POPC”) .

14. Un método de generación de una variante polipeptídica que tenga actividad de flujo de salida de colesterol y/o actividad de estabilización de ABCA, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;

(b) modificar al menos una posición de aminoácido de dicho polipéptido para generar una variante polipeptídica;

(c) explorar dicha variante polipeptídica para determinar la actividad de flujo de salida de colesterol y/o la actividad de estabilización de ABCA;

(d) seleccionar dicha variante polipeptídica que tiene al menos el 80% de la actividad de flujo de salida de colesterol del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o seleccionar dicha variante polipeptídica que tiene al menos el 80% de la actividad de estabilización de ABCA del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; y sintetizar la variante polipeptídica seleccionada.

15. Un kit para tratar un síntoma de aterosclerosis, comprendiendo dicho kit un recipiente que contiene un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un peptidomimético de la reivindicación 11, opcionalmente en el que

(a) el kit comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable; o

(b) dicho polipéptido está combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable en una formulación de dosificación unitaria.

16. Un polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un peptidomimético de la reivindicación 11 para su uso en un método de terapia para un trastorno tal como:

(a) un trastorno asociado con dislipidemia;

(b) un trastorno del flujo de salida de colesterol;

(c) hipercolesterolemia;

(d) inflamación;

(e) aterosclerosis o un síntoma de aterosclerosis; o

(f) una placa vulnerable.

17. Uso de un polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un peptidomimético de la reivindicación 11 para unirse a ABCA in vitro.

18. Un ligando de afinidad detectable que comprende un polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un peptidomimético de la reivindicación 11 unido directa o indirectamente a un resto detectable, opcionalmente en el que dicho marcador se selecciona del grupo que consiste en colorantes fluorescentes, metales, colorantes cromofóricos, compuestos quimioluminiscentes, proteínas bioluminiscentes, enzimas, radioisótopos, partículas de óxido de hierro magnético, vesículas que contienen gas y puntos cuánticos.