Marcadores de ECL que tienen propiedades de enlace no específico mejoradas, métodos de uso y kits que los contienen.

Un ligando de bipiridina o fenantrolina seleccionado del grupo que consiste en:

en donde, T es una unión alquilo que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo;

Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o –NHC (NH) NH2; y

R es alquilo,

con la condición que el ligando no sea un anión radical de 4, 4’-dipropilsulfonato-2, 2’-bipiridinio.

Marcadores de ECL que tienen propiedades de enlace no específico mejoradas, métodos de uso y kits que los contienen

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Se hace referencia a las siguientes patentes publicadas: Patentes de EE.UU. núms. 5.310.687; 5.591.581; 5.597.910; 5.705.402; 5.846.485; 6.066.448; 6.214.552 y 6.207.369.

Campo de invención

La presente invención se refiere a marcadores, preferiblemente marcadores que contienen metal para usar en ensayos. En particular, la invención se refiere a marcadores metálicos que tienen ligandos sustituidos con grupos hidrófilos y/o cargados que evitan el enlace no específico (“NSB”) de sustancias marcadas a otros materiales. La invención se refiere además a métodos para llevar a cabo ensayos, preferiblemente ensayos de luminiscencia, que usan estos marcadores y a kits y composiciones que contienen estos marcadores.

Antecedentes de la invención

Los documentos citados en esta solicitud se refieren al estado de la técnica a la que pertenece esta invención.

La detección de electroquimioluminiscencia (ECL) ha llegado a ser una importante técnica analítica y se ha aplicado en procedimientos de análisis general y diagnóstico. La electroquimioluminiscencia implica especies electrogeneradas y la emisión de luz. Por ejemplo, la electroquimioluminiscencia puede implicar luminiscencia generada mediante un procedimiento en que se generan uno o más reactivos de forma electroquímica y experimentan una o más reacciones químicas para producir especies que emiten luz, preferiblemente de forma repetida.

En la práctica, la mayoría de ensayos basados en ECL implican el uso de compuestos electroquimioluminiscentes como marcadores. La presencia de una sustancia marcada o la participación de una sustancia marcada en una reacción de enlace se determina por medio de la detección de electroquimioluminiscencia a partir del marcador de ECL. Los ensayos para los analitos basados en el uso de reactivos de enlace marcados específicos para un analito de interés pueden ser homogéneos en la naturaleza (véase la Patente de EE.UU. núm. 5.591.581 y la Solicitud PCT Publicada WO87/06706) o pueden implicar reacciones de enlace que se dan en una fase sólida tal como una partícula magnética (véase la Patente de EE.UU. núm. 5.705.402) o una superficie de electrodo (véanse las Patentes de EE.UU. núms. 6.066.448 y 6.207.369 y la Solicitud PCT Publicada WO98/12539) .

Una clase importante de marcadores de ECL es la de complejos organometálicos de rutenio, osmio o renio que tienen uno o más ligandos que contienen nitrógeno, heterocíclicos, polidentados (por ejemplo, bipiridina, fenantrolina, bipirazina, bipirimidina, etc., o derivados sustituidos de los mismos) , tales como los descritos en las Patentes de EE.UU. núms. 5.310.687; 5.597.910 y 5.591.581 y la Solicitud PCT Publicada WO87/06706. Estos tipos de marcadores (en particular, marcadores basados en complejos de tris-bipiridil-rutenio) han encontrado un uso considerable por su estabilidad y la eficacia a la que producen ECL.

En instrumentación de ECL comercial, la ECL desde estos marcadores se produce típicamente por oxidación de los marcadores en presencia de un co-reactivo de ECL, tal como tripropilamina. El co-reactivo de ECL se oxida también en el electrodo para producir un reductor fuerte (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. núm. 5.846.485) . La reacción altamente energética del reductor y el marcador oxidado lleva a la reducción y excitación del marcador a un estado excitado luminiscente. La emisión de un fotón regenera el marcador en su estado original y permite la detección del marcador.

La electroquimioluminiscencia es una técnica de detección extremadamente sensible. La sensibilidad de la técnica de detección no es a menudo, sin embargo, el factor determinante para la sensibilidad de un ensayo particular. En los ensayos que implican la interacción de enlace específico entre un reactivo de enlace marcado y un compañero de enlace (por ejemplo, un analito) , la sensibilidad está a menudo limitada por la señal de fondo resultante a partir del enlace no específico (NSB) del reactivo de enlace marcado con sustancias distintas del compañero de enlace, por ejemplo, otros componentes de muestras en bruto, otros reactivos de ensayo, o en el caso de ensayos de enlace en fase sólida, la fase sólida en sí misma. En algunos casos, el NSB puede llevar además a una disminución de señales a través de la pérdida de reactivo en las superficies de envases, pipetas, etc. Mientras los marcadores de ECL tienen generalmente mejores propiedades de NSB que otras clases de marcadores, bajo ciertas condiciones, el NSB puede ser un factor limitante en la sensibilidad del ensayo. Esto se da, por ejemplo, en i) ensayos de ECL que usan reactivos de enlace marcados, donde el reactivo de enlace en sí mismo muestra altos niveles de NSB; ii) ensayos de ECL que usan reactivos de enlace marcados con números grandes de marcadores y iii) ensayos de ECL llevados a cabo usando bajas concentraciones de bloqueantes de NSB (tales como proteínas de bloqueo o detergentes) o llevados a cabo en ausencia de dichos bloqueantes.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a bipiridinas y fenantrolinas sustituidas que tienen al menos uno y preferiblemente dos sustituyentes, comprendiendo los sustituyentes grupos cargados de forma negativa, preferiblemente grupos sulfato o sulfonato. Estas bipiridinas y fenantrolinas sustituidas, cuando están presentes como un ligando en un

complejo metálico, reducen el NSB del complejo respecto a bipiridinas o fenantrolinas no sustituidas análogas. Además, la presente invención se refiere a complejos organometálicos que comprenden dichos ligandos y reactivos de ensayo marcados que comprenden dichos complejos organometálicos.

La presente invención se refiere además a complejos metálicos luminiscentes que tienen la estructura

ML1L22

en donde

M es Os o Ru;

L1 es L2 como se describe debajo o un ligando de bipiridina o fenantrolina sustituida que tiene al menos un sustituyente que está unido de forma covalente a i) un material biológico y/o un reactivo de ensayo útil en un ensayo

o ii) un resto que puede participar en una reacción con un material biológico y/o un reactivo de ensayo útil en un 15 ensayo para así formar dicha unión covalente; y

L2 es un ligando de bipiridina o fenantrolina sustituida que comprende un grupo cargado de forma negativa, preferiblemente un grupo sulfato o sulfonato, actuando dicho grupo para reducir el NSB del complejo respecto al complejo análogo en que L2 es bipiridina o fenantrolina no sustituida. De forma alternativa, L2 es un ligando de bipiridina o fenantrolina sustituida que comprende un grupo hidrófilo neutro, preferiblemente un grupo hidroxilo o una

carboxamida, o un grupo cargado de forma positiva, preferiblemente, un grupo guanidinio.

La presente invención se refiere además a complejos metálicos luminiscentes que tienen la estructura

ML1L22

en donde

M es Os o Ru;

L2 es un ligando metálico seleccionado a partir del grupo que consiste en:

en donde,

T es un grupo de unión que comprende una unión alquilo, alquenilo, alquinilo o fenilo, o una combinación de los mismos, que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo;

Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -PO32-, -PO3H-, -PO3H2, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, [NHC (NH2) 2]+ o –NHC (NH) NH2; y R es alquilo; y

L1 es un ligando de bipiridina o fenantrolina sustituida que tiene al menos un sustituyente que está unido de forma covalente a i) un material biológico y/o un reactivo de enlace útil en un ensayo o ii) un resto que puede participar en una reacción con un material biológico y/o un reactivo de enlace útil en un ensayo para así formar dicha unión

covalente; y L1 se selecciona, preferiblemente, a partir del grupo que consiste en

en donde,

X es un grupo de unión que comprende una unión alquilo, alquenilo, alquinilo o fenilo, o una combinación de los mismos, que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos... [Seguir leyendo]

1. Un ligando de bipiridina o fenantrolina seleccionado del grupo que consiste en:

en donde, 5 T es una unión alquilo que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo;

Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o –NHC (NH) NH2; y R es alquilo, con la condición que el ligando no sea un anión radical de 4, 4’-dipropilsulfonato-2, 2’-bipiridinio.

2. El ligando según la reivindicación 1, en donde T es – (CH2) n- y n es un número entero entre 1 y 5.

3. El ligando según la reivindicación 1 o 2, en donde Z es –SO3- o –SO3H.

4. El ligando según la reivindicación 1 o 2, en donde Z es –OSO3-o –OSO3H.

-

5. El ligando según la reivindicación 1 o 2, en donde Z es –OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (Me) O2 o –OP (Me) O2H.

6. El ligando según la reivindicación 1 o 2, en donde Z es –[NHC (NH2) 2]+ o –NHC (NH) NH2.

7. Un complejo metálico luminiscente que comprende el ligando según la reivindicación 2, y un átomo metálico, estando el átomo metálico unido a los nitrógenos anulares del ligando.

8. Un método para llevar a cabo un ensayo basado en luminiscencia que comprende las etapas de:

(a) usar un complejo metálico luminiscente que comprende un ligando seleccionado del grupo que consiste en

en donde, T es una unión alquilo que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo; Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o –

NHC (NH) NH2; R es alquilo; y 25 dicho complejo metálico comprende un átomo metálico que está unido a los nitrógenos del anillo de dicho ligando;

(b) inducir a dicho complejo metálico a emitir luminiscencia; y

(c) medir la luminiscencia emitida.

9. Un método como se enumera según la reivindicación 8, en donde dicho complejo metálico muestra enlace no específico reducido en dicho ensayo respecto al complejo análogo que tiene Z = H. 30 10. Un complejo metálico luminiscente que tiene la estructura

M (L1) 3 en donde

M es Os o Ru; y L1 es un ligando seleccionado del grupo que consiste en:

en donde, 5 T es una unión alquilo que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo;

Z es –SO3-, -SO3H, OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o – NHC (NH) NH2; y R es alquilo.

11. Un método para llevar a cabo un ensayo basado en luminiscencia que comprende las etapas de: 10 (a) usar un complejo metálico luminiscente que tiene la estructura

M (L1) 3 en donde M es Os o Ru; y L1 es un ligando seleccionado del grupo que consiste en:

en donde, T es una unión alquilo que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo; Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o –

NHC (NH) NH2; y 20 R es alquilo;

(b) inducir a dicho complejo metálico a emitir luminiscencia; y

(c) medir la luminiscencia emitida.

12. Un método como se enumera según la reivindicación 11, en donde dicho complejo metálico muestra enlace no específico reducido en dicho ensayo respecto al complejo análogo que tiene Z = H. 25 13. Un complejo metálico luminiscente que tiene la estructura ML1L22 en donde M es Os o Ru; L1 es un ligando de bipiridina o fenantrolina sustituido que tiene al menos un sustituyente que puede reaccionar con 30 un material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo para así formar una unión

covalente; y L2 es un ligando metálico seleccionado del grupo que consiste en:

en donde,

T es un grupo de unión que comprende una unión alquilo, alquenilo, alquinilo o fenilo, o una combinación de los mismos, que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo;

Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o – NHC (NH) NH2; y

R es alquilo; y en donde

el material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos y ácidos 10 peptidonucleicos.

14. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 13, en donde L1 se selecciona a partir del grupo que consiste en

en donde,

X es un grupo de unión que comprende una unión alquilo, alquenilo, alquinilo o fenilo, o una combinación de los mismos, que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo; Y es H o alquilo y W es un sustituyente que puede reaccionar con el material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro

reactivo de ensayo para así formar una unión covalente. 20 15. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 13, en donde Z es –SO3- o –SO3H.

16. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 13, en donde Z es –OSO3- o –OSO3H.

17. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 13, en donde Z es –OPO32-, OPO3H-, OPO3H2, -OP (Me) O2-o –OP (Me) O2H.

18. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 13, en donde Z es –[NHC (NH2) 2]+ o –NHC (NH) NH2. 25 19. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 13, en donde M es Ru.

20. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 13, en donde W es un cloruro de acilo o un éster de Nhidroxisuccinimida.

21. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 13, en donde W es un grupo ácido carboxílico, un grupo amina o un grupo hidroxilo. 30 22. Un complejo metálico luminiscente que tiene la estructura ML1L22 en donde

M es Os o Ru; L1 se selecciona del grupo que consiste en

en donde, X es una unión alquilo que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo; Y es H o alquilo y W es un grupo funcional que puede reaccionar con un material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u

otro reactivo de ensayo para así formar una unión covalente; y L2 es un ligando metálico seleccionado del grupo que consiste en:

en donde,

T es una unión alquilo que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo; y

Z es –SO3-o –SO3H; y en donde

el material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos y ácidos 15 peptidonucleicos.

23. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 22, en donde M es Ru.

24. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 22, en donde T es – (CH2) n-, X es – (CH2) m-y n y m son cada uno números enteros entre 1 a 5.

25. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 22, en donde L2 es un ligando fenantrolina sustituido 20 en las posiciones 4 y 7 o L2 es un ligando bipiridina sustituido en las posiciones 4 y 4’.

26. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 22, en donde W es un cloruro de acilo o un éster de N-hidroxisuccinimida.

27. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 22, en donde W es un grupo ácido carboxílico, un grupo amino o un grupo tiol.

28. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 22, en donde W es

29. Un complejo metálico luminiscente con la estructura:

en donde W es un grupo funcional que puede reaccionar con un material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo para así formar una unión covalente; y en donde

el material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos y ácidos peptidonucleicos.

30. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 29, en donde W es un cloruro de acilo o un éster de Nhidroxisuccinimida.

31. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 29, en donde W es un grupo ácido carboxílico, un grupo amino o un grupo hidroxilo.

32. El complejo metálico luminiscente según la reivindicación 29, en donde W es

33. Un material marcado que comprende un complejo metálico luminiscente que tiene la estructura

ML1L22 en donde M es Os o Ru; L1 es un ligando bipiridina o fenantrolina sustituido que tiene al menos un sustituyente que está unido de forma

covalente a un material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo; y 20 L2 es un ligando metálico seleccionado del grupo que consiste en:

en donde, T es un grupo de unión que comprende una unión alquilo, alquenilo, alquinilo o fenilo, o una combinación de los mismos, que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo;

Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o – NHC (NH) NH2; y R es alquilo; y en donde

el material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos y ácidos peptidonucleicos.

34. El material marcado según la reivindicación 33, en donde L1 se selecciona del grupo que consiste en

en donde,

X es un grupo de unión que comprende una unión alquilo, alquenilo, alquinilo o fenilo, o una combinación de los mismos, que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo; Y es H o alquilo;

B es el material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo; y W es un grupo funcional que se une a B.

35. El material marcado según la reivindicación 33, en donde Z es –SO3-o –SO3H.

36. El material marcado según la reivindicación 33, en donde Z es –OSO3-o –OSO3H.

-

37. El material marcado según la reivindicación 33, en donde Z es –OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (Me) O2 o 15 –OP (Me) O2H.

38. El material marcado según la reivindicación 33, en donde Z es –[NHC (NH2) 2]+ o –NHC (NH) NH2.

39. El material marcado según la reivindicación 33, en donde M es Ru.

40. El material marcado según la reivindicación 33, en donde el complejo muestra menos enlace no específico que el complejo análogo en que Z es H.

41. El material marcado según la reivindicación 33, en donde dicho material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se une a cinco o más de dichos complejos metálicos luminiscentes.

42. El material marcado según la reivindicación 33, en donde dicho material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se une a diez o más de dichos complejos metálicos luminiscentes.

43. Un método para llevar a cabo un ensayo basado en luminiscencia que comprende las etapas de: 25 (a) usar un material marcado que comprende un complejo metálico luminiscente que tiene la estructura

ML1L22 en donde M es Os o Ru; L1 es un ligando de bipiridina o fenantrolina sustituido que tiene al menos un sustituyente que está unido de forma

covalente a un material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo; y L2 es un ligando metálico seleccionado del grupo que consiste en:

en donde,

T es un grupo de unión que comprende una unión alquilo, alquenilo, alquinilo o fenilo, o una combinación de los 35 mismos, que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo;

Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o –NHC (NH) NH2; y

R es alquilo;

(b) inducir a dicho complejo metálico a emitir luminiscencia; y

(c) medir la luminiscencia emitida; y en donde

el material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos y ácidos peptidonucleicos.

44. El método según la reivindicación 43, en donde dicho material marcado muestra enlace no específico reducido 10 en dicho ensayo respecto al material marcado análogo que tiene Z = H.

45. Un material marcado que comprende un complejo metálico luminiscente que tiene la estructura

ML1L22 en donde M es Os o Ru;

L1 se selecciona del grupo que consiste en

en donde,

X es una unión alquilo que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo;

Y es H o alquilo y 20 W es un grupo funcional que está unido a un material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro

reactivo de ensayo; y

L2 es un ligando metálico seleccionado del grupo que consiste en:

en donde,

T es una unión alquilo que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo; y

Z es –SO3-o –SO3H; y en donde

el material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos y ácidos 30 peptidonucleicos.

46. El material marcado según la reivindicación 45, en donde M es Ru.

47. El material marcado según la reivindicación 45, en donde T es – (CH2) n-, X es – (CH2) m- y n y m son cada uno número enteros entre 1 a 5.

48. El material marcado según la reivindicación 45, en donde L2 es un ligando fenantrolina sustituido en las 35 posiciones 4 y 7 o L2 es un ligando bipiridina sustituido en las posiciones 4 y 4’.

49. El material marcado según la reivindicación 45, en donde el complejo muestra menos enlace no específico que el complejo análogo en que Z es H.

50. El material marcado según la reivindicación 45, en donde dicho material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se une a 5 o más de dichos complejos metálicos luminiscentes.

51. El material marcado según la reivindicación 45, en donde dicho material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se une a 10 o más de dichos complejos metálicos luminiscentes.

52. Un método para llevar a cabo un ensayo basado en luminiscencia que comprende las etapas de:

(a) usar un material marcado que comprende un complejo metálico luminiscente que tiene la estructura ML1L22

en donde M es Os o Ru; L1 se selecciona del grupo que consiste en

en donde,

X es una unión alquilo que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo; Y es H o alquilo; y W es un grupo funcional que está unido a un material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro

reactivo de ensayo; seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, proteínas, péptidos, 20 peptidomiméticos, ácidos nucleicos y ácidos peptidonucleicos y L2 en un ligando metálico seleccionado del grupo que consiste en:

en donde,

T es una unión alquilo que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo; 25 y

Z es –SO3-o –SO3H;

(b) inducir a dicho complejo metálico a emitir luminiscencia; y

(c) medir la luminiscencia emitida.

53. El método según la reivindicación 52, en donde dicho material marcado muestra enlace no específico reducido 30 en dicho ensayo respecto al material marcado análogo que tiene Z = H.

54. Un material marcado que comprende un complejo metálico luminiscente con la estructura: en donde W es un grupo funcional que está unido a un material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo; y en donde

el material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos y ácidos peptidonucleicos.

55. El material marcado según la reivindicación 54, en donde (i) W es –C (O) - y (ii) dicho material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se une a W por medio de un enlace amida.

56. El material marcado según la reivindicación 54, donde dicho material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se une a 5 o más de dichos complejos metálicos luminiscentes.

57. El material marcado según la reivindicación 54, en donde dicho material biológico, reactivo de enlace, sustrato enzimático u otro reactivo de ensayo se une a 10 o más de dichos complejos metálicos luminiscentes.

58. Un método para llevar a cabo un ensayo basado en luminiscencia que comprende las etapas de:

(a) usar el material marcado según la reivindicación 54

(b) inducir a dicho material marcado a emitir luminiscencia; y

(c) medir la luminiscencia emitida.

59. El método según la reivindicación 58, en donde dicho material marcado muestra enlace no específico reducido en dicho ensayo relativo al material marcado análogo que tiene Z = H.

60. Un método de medida de un analito, actividad química o actividad biológica en una muestra que comprende las etapas de i) poner en contacto una muestra que contiene el analito, actividad química, actividad biológica, un producto de la actividad biológica o un producto de la actividad química con el complejo metálico luminiscente de la reivindicación 13; ii) inducir al complejo metálico a emitir luminiscencia y iii) medir la luminiscencia para así detectar o medir la actividad química o biológica.

61. El método según la reivindicación 60, en donde dicho material marcado muestra menos enlace no específico en dicho ensayo cuando se compara a un material marcado que tiene un ligando análogo que no presenta grupos funcionales que reducen el enlace no específico.

62. El método según la reivindicación 60 o 61, en donde dicha luminiscencia es electroquimioluminiscencia.

63. Un método de medida de un material marcado que comprende las etapas de i) poner en contacto el material marcado con un reactivo de enlace y, opcionalmente, un soporte en fase sólida; ii) formar un complejo de enlace que comprende el reactivo de enlace, el material marcado, y, opcionalmente, el soporte en fase sólida; iii) inducir al material marcado a emitir luminiscencia y iv) medir la luminiscencia emitida para así medir el material marcado; en donde el material marcado se prepara a partir del metal luminiscente según la reivindicación 13.

64. El método según la reivindicación 63, en donde dicho material marcado se pone en contacto con dicha fase sólida y dicho complejo de enlace se forma en dicha fase sólida.

65. El método según la reivindicación 63, en donde dicho material marcado muestra menos enlace no específico en dicho ensayo cuando se compara a un material marcado análogo que tiene un ligando análogo que no presenta grupos funcionales que reducen el enlace no específico;

en donde los grupos funcionales que reducen el enlace no específico se seleccionan del grupo que consiste en – SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o – NHC (NH) NH2.

66. El método según la reivindicación 63, en donde dicha luminiscencia es electroquimioluminiscencia.

67. Un método de medida de un analito en una muestra que comprende las etapas de i) poner en contacto la muestra con un reactivo de enlace marcado y opcionalmente un soporte en fase sólida; ii) formar un complejo de enlace que comprende el reactivo de enlace, el analito y, opcionalmente, el soporte en fase sólida, iii) inducir a los marcadores en el reactivo de enlace marcado a emitir luminiscencia, preferiblemente ECL y iv) medir la luminiscencia emitida para así medir el analito en la muestra; en donde dicho reactivo de enlace marcado se prepara

a partir del complejo metálico luminiscente de la reivindicación 13.

68. El método según la reivindicación 67, en donde dicho complejo de enlace se forma en dicha fase sólida.

69. El método según la reivindicación 67, en donde dicho reactivo de enlace marcado se pone en contacto con dicha fase sólida y dicho complejo de enlace se forma en dicha fase sólida.

70. El método según la reivindicación 67, en donde dicho reactivo de enlace marcado muestra menos enlace no

específico en dicho ensayo cuando se compara con los reactivos de enlace marcados análogos que no tiene marcadores que presenten grupos funcionales reductores de enlace no específico.

71. El método según la reivindicación 67, en donde dicha luminiscencia es electroquimioluminiscencia.

72. El método según la reivindicación 67, en donde dicho ensayo es un ensayo en sándwich.

73. El método según la reivindicación 67, en donde dicho ensayo es un ensayo competitivo.

74. Un método de medida de un analito en una muestra que comprende las etapas de i) poner en contacto la muestra con un análogo marcado del analito, un reactivo de enlace y, opcionalmente, un soporte en fase sólida; ii) formar un complejo de enlace que comprende el análogo marcado del analito, el reactivo de enlace y, opcionalmente, el soporte en fase sólida; iii) inducir a los marcadores en el análogo marcado del analito a emitir luminiscencia, preferiblemente ECL y iv) medir la luminiscencia emitida para así medir el analito en la muestra; en

donde dicho análogo marcado del analito se prepara a partir del complejo metálico luminiscente de la reivindicación

13.

75. El método según la reivindicación 74, en donde dicho análogo marcado del analito se pone en contacto con dicha fase sólida y dicho complejo de enlace se forma en dicha fase sólida.

76. El método según la reivindicación 74, en donde dicho análogo marcado del analito muestra menos enlace no

específico en dicho ensayo cuando se compara con los reactivos análogos que no presentan grupos funcionales reductores del enlace no específico.

77. El método según la reivindicación 74, en donde dicha luminiscencia es electroquimioluminiscencia.

78. Un método para mejorar un ensayo de luminiscencia que emplea un complejo metálico luminiscente que

contiene un ligando bipiridina, fenantrolina, bipiridina sustituida o fenantrolina sustituida, comprendiendo dicho 35 método la etapa de sustituir dicho ligando con un ligando seleccionado del grupo que consiste en

en donde, T es una unión alquilo que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo; Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o –

NHC (NH) NH2; y R es alquilo.

79. El método según la reivindicación 78, en donde dicha sustitución mejora la señal del ensayo al fondo mediante un factor de dos o más.

80. Un equipo que comprende, en uno o más envases, un material marcado que comprende un complejo metálico luminiscente que tiene la estructura ML1L22 en donde

M es Os o Ru; L1 es un ligando bipiridina o fenantrolina sustituido que tiene al menos un sustituyente que está unido de forma covalente a una sustancia de realización del ensayo; y

L2 es un ligando metálico seleccionado del grupo que consiste en:

en donde,

T es un grupo de unión que comprende una unión alquilo, alquenilo, alquinilo o fenilo, o una combinación de los mismos, que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo; Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o –

NHC (NH) NH2; y 15 R es alquilo; y al menos un componente del ensayo seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un co-reactivo de electroquimioluminiscencia;

(b) uno o más reactivos de enlace;

(c) uno o más tampones de pH. 20 81. Un material marcado que comprende un complejo metálico luminiscente que tiene la estructura

ML1L22 en donde M es Os o Ru; L1 es un ligando bipiridina o fenantrolina sustituido que tiene al menos un sustituyente que está unido de forma

covalente a una sustancia de realización del ensayo; y L2 es un ligando metálico seleccionado del grupo que consiste en:

en donde,

T es un grupo de unión que comprende una unión alquilo, alquenilo, alquinilo o fenilo, o una combinación de los 30 mismos, que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo;

Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o –

NHC (NH) NH2; y

R es alquilo.

82. Un material marcado según la reivindicación 81, en donde dicha sustancia de realización del ensayo se selecciona del grupo que consiste en:

(a) analito de interés añadido;

(b) un compañero de enlace de dicho analito; y 5 (c) un componente reactivo capaz de enlazar con (a) o (b) .

83. Una composición de materia para usar como un reactivo en un ensayo que comprende:

(a) un material marcado que comprende un complejo metálico luminiscente que tiene la estructura ML1L22 en donde 10 M es Os o Ru;

L1 es un ligando bipiridina o fenantrolina sustituido que tiene al menos un sustituyente que está unido de forma covalente a una sustancia de realización del ensayo; y L2 es un ligando metálico seleccionado del grupo que consiste en:

en donde,

T es un grupo de unión que comprende una unión alquilo, alquenilo, alquinilo o fenilo, o una combinación de los mismos, que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo; Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o –

NHC (NH) NH2; y 20 R es alquilo; y

(b) al menos un componente de ensayo adicional seleccionado del grupo que consiste en:

(i) electrolito;

(ii) analito de interés;

(iii) un compañero de enlace del analito de interés; 25 (iv) un componente reactivo capaz de reaccionar con (ii) o (iii) ; y

(v) un co-reactivo de ECL,

con la condición que, sin embargo, no sean dos componentes contenidos en cualquier composición reactiva, reactivos el uno con el otro durante el almacenaje para así perjudicar su función en el ensayo pretendido.

84. Una composición de materia para la detección de un analito de interés presente en una muestra, cuya 30 composición comprende un material marcado que comprende un complejo metálico luminiscente que tiene la estructura ML1L22 en donde M es Os o Ru; 35 L1 es un ligando bipiridina o fenantrolina sustituido que tiene al menos un sustituyente que está unido de forma

covalente a una sustancia de realización del ensayo; y L2 es un ligando metálico seleccionado del grupo que consiste en:

en donde, T es un grupo de unión que comprende una unión alquilo, alquenilo, alquinilo o fenilo, o una combinación de los mismos, que tiene, opcionalmente, uno o más carbonos de la cadena sustituidos con un heteroátomo;

Z es –SO3-, -SO3H, -OSO3-, -OSO3H, -OPO32-, -OPO3H-, -OPO3H2, -OP (R) O2-, -OP (R) O2H, -[NHC (NH2) 2]+ o – NHC (NH) NH2; y R es alquilo, siendo dicha sustancia de realización de ensayo capaz de enlazar al analito de interés o enlazarse al analito de

interés. 10 85. Una composición de materia según la reivindicación 84, en donde dicha composición contiene al menos una sustancia adicional seleccionada del grupo que consiste en

(i) analito de interés añadido;

(ii) un compañero de enlace de dicho analito; y

(iii) un componente reactivo capaz de enlazar con (i) o (ii) . 15 86. El ligando según la reivindicación 3, en donde n = 1.

87. El complejo luminiscente según la reivindicación 22, en donde M es Os.

88. El material marcado según la reivindicación 35, en donde M es Ru.

89. El material marcado según la reivindicación 45, en donde M es Os.