Combinación de líneas celulares de melanoma humano para el tratamiento de enfermedades malignas caracterizada porque dicha combinación comprende las líneas celulares (a) Mel-XY1 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2830),

(b) Mel-XY2 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2829) y (e) subpoblaciones de las mismas.

Líneas celulares, composiciones que las comprenden para el tratamiento de los melanomas, procedimientos para preparar las composiciones y métodos de tratamiento.

La presente invención se refiere a líneas celulares, composiciones para el tratamiento de melanomas que las comprenden, procedimientos para preparar las composiciones y métodos de tratamiento. Más particularmente la invención se refiere a varias líneas celulares de melanoma humano para el tratamiento de enfermedades malignas, en las que las líneas celulares son: (a) Mel-XY1 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2831) , (c) Mel-XY3 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2832) , (d) Mel-XX4 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2829) o (e) subpoblaciones de las mismas. Las líneas celulares pueden ser irradiadas obteniéndose poblaciones con fenotipo apoptósico y poblaciones con fenotipo necrótico de dichas líneas. Las composiciones pueden comprender adyuvantes y/o inmunomodificadores y/o células dendríticas autólogas.

Antecedentes de la invención

En la actualidad se realizan muchos esfuerzos y se destinan muchos recursos para investigar en el área de la inmunoteprapia del cáncer. Existen importantes evidencias que indican el rol central de los linfocitos T en las respuestas inmunes efectivas contra el cáncer (Oliver RT, Nouri AM. T; Cancer Surv 1992; 13:173-204) . Para ello se han utilizado en los tratamientos células alogeneicas solas, con adyuvantes, o en combinación con inmunomoduladores tales como algunas citoquinas.

Por otra parte es conocido que las células dendríticas (CD) son las células presentadoras de antígenos que pueden iniciar una respuesta de células T debido a su extraordinaria capacidad para estimular los linfocitos T naive (Schuler G, Steinman RM. J Exp. Med 1997; 186:1183-7 y Banchereau J, Steinman RM. Nature 1998; 392:245-52) .

Varios autores han demostrado en modelos murinos y en humanos que las CD incorporan células apoptósicas, y de esta manera se presentan los antígenos para la generación de complejos HLA clase I/péptidos, permitiendo la inducción de linfocitos T citotóxicos (Albert ML, Pearce SF, Francisco LM, Sauter B, Roy P, Silverstein RL, Bhardwaj

N. J Exp Med. 1998, 188: 1359-1368; Chen Z, Moyana T, Saxena A, Warrington R, Jia Z, Xiang J. Int J Cancer. 2001, 93: 539-548 y Shaif-Muthana M, McIntyre C, Sisley K, Rennie I, Murray A. Cancer Res. 2000, 60: 6441-6447) . Para este proceso es fundamental que las células apoptósicas induzcan la maduración de las células dendríticas (CD) , sin embargo muchos autores han reportado que las células apoptósicas humanas no maduran a las CD o inducen a la pérdida de la maduración de dichas CD (Pietra G, Mortarini R, Parmiani G, Anichini A. Cancer Res 2001, 61: 8218-8226; Labarriere N, Bretaudeau L, Gervois N, Bodinier M, Bougras G, Diez E, Lang F, Gregoire M, Jotereau F. Int J Cancer 2002, 101: 280-286 y Demaria S, Santori FR, Ng B, Liebes L, Formenti SC, Vukmanovic S. J Leukoc Biol. 2005, 77: 361-368) .

La patente US nº 6.187.306 de Pardoll y colaboradores divulga un método para tratar o proteger contra el melanoma que comprende utilizar al menos una línea celular alogeneica o más que expresen antígenos inmunodominantes de melanoma, en donde la línea celular ha sido modificada de manera tal que expresa citoquinas y administrar dicha línea transformada a un paciente que presenta melanoma o se encuentra en riesgo de adquirir la enfermedad. Si bien se destaca la importancia que la línea celular o las líneas celulares empleadas expresen la mayoría de los antígenos inmunodominantes no se divulga una nueva línea celular o combinación de líneas celulares que expresen la mayoría de dichos antígenos. La invención comprende fundamentalmente líneas celulares transformadas que expresan citoquinas tales como GM-CSF.

Las patentes nº US 5.882.654 y nº US 5.840.317 divulgan líneas celulares de melanoma irradiadas para utilizarse como vacunas alogeneicas. El tratamiento divulgado alcanza valores inferiores al 50% de pacientes NED (16/37) y se muestra una efectiva actividad antitumoral de tipo humoral.

El documento de patente US 2006/0034811 de Wallack y colaboradores divulga vacunas comprendidas por células presentadoras de antígenos cargadas con células tumorales lisadas o rotas que incluyen al citosol y las membranas. Las células tumorales pueden ser células del paciente, líneas celulares o células que han sido infectadas con el virus vaccinia recombinante que codifica a IL-2. En el documento de patente US 2006/0140983 de Palucka y colaboradores se divulga una composición para inducir inmunidad en pacientes con cáncer que comprende aislar y purificar células presentadoras de antígenos cebadas por exposición con una o más proteínas de choque térmico y células tumorales muertas. Las células presentadoras de antígenos son células dendríticas y las células tumorales pueden ser células singeneicas o alogeneicas, por ejemplo líneas celulares. Este documento divulga la necesidad de incorporar proteínas de choque térmico a través de la ruptura por calentamiento de células tumorales. Los ensayos mostrados no revelan necesariamente que la composición tenga actividad inductora de la inmunidad en pacientes con melanoma.

La patente US nº 6.602.709 de Albert y colaboradores se divulga el uso de células apoptósicas para presentar antígenos a las células dendríticas para la inducción de células T. El método es útil para inducir linfocitos T citotóxicos antígeno específicos y células T cooperadoras. Las células dendríticas son cebadas por células apoptósicas o fragmentos de las mismas y son capaces de procesar y presentar a los antígenos procesados e inducir la actividad de linfocitos T citotóxicos, pudiendo ser empleadas como vacunas terapéuticas.

Breve descripción de la invención

En un aspecto de la presente invención están previstas varias líneas celulares de melanoma humano para el tratamiento de enfermedades malignas, en las que las líneas celulares son (a) Mel-XY1 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2831) , (c) Mel-XY3 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2832) , (d) Mel-XX4 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2829) o (e) subpoblaciones de las mismas. Las líneas celulares pueden ser posteriormente irradiadas obteniéndose poblaciones con fenotipo apoptósico y poblaciones con fenotipo necrótico de dichas líneas.

En otro aspecto de la presente invención está prevista una composición para el tratamiento del melanoma, en donde dicha composición comprende al menos una línea celular de melanoma alogeneica, por ejemplo (a) Mel-XY1 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2831) , (c) Mel-XY3 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2832) , (d) Mel-XX4 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2829) o combinaciones de las mismas, en donde dichas líneas celulares son incapaces de proliferar. La composición puede también comprender excipientes, adyuvantes tales como BCG e inmunomoduladores tales como GM-CSF o IFNα. En una forma de realización preferida la composición comprende combinaciones de las cuatro líneas celulares de melanoma alogeneicas (a) Mel-XY1 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2831) , (c) Mel-XY3 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2832) y (d) Mel-XX4 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM... [Seguir leyendo]

1. Combinación de líneas celulares de melanoma humano para el tratamiento de enfermedades malignas caracterizada porque dicha combinación comprende las líneas celulares (a) Mel-XY1 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2831) , (c) Mel-XY3 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2832) , (d) Mel-XX4 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2829) y (e) subpoblaciones de las mismas.

2. Combinación de líneas celulares según la reivindicación 1, caracterizada porque dichas líneas celulares han sido irradiadas, y no pueden proliferar.

3. Combinación de líneas celulares según la reivindicación 1, caracterizada porque las líneas celulares a) , b) , c) y d) comprenden una población de células con fenotipo apoptósico.

4. Combinación de líneas celulares según la reivindicación 3, caracterizada porque la población de células apoptósicas comprende una cantidad de 35% a 60% de dichas células.

5. Combinación de líneas celulares según la reivindicación 1, caracterizada porque las líneas celulares a) , b) , c) y d) comprenden una población de células con fenotipo necrótico.

6. Combinación de líneas celulares según la reivindicación 5, caracterizada porque la población de células necróticas comprende una cantidad de 10% a 25% de dichas células.

7. Combinación de líneas celulares según la reivindicación 1, caracterizada porque la subpoblación comprende células de melanoma humano que pueden formar colonias en agaragar blando.

8. Composición para su utilización en el tratamiento del melanoma, caracterizada porque comprende una combinación de línea celular de melanoma alogeneica (a) Mel-XY1 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2831) , (c) Mel-XY3 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2832) , (d) Mel-XX4 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2829) en la que dichas líneas celulares han sido irradiadas y no pueden proliferar.

9. Composición para su utilización en el tratamiento de melanomas humanos, caracterizada porque comprende células dendríticas autólogas maduras; células dendríticas autólogas cargadas con una combinación de líneas célulares de melanoma humano heterólogo; células apoptósicas de dicha combinación de líneas celulares de melanoma humano heterólogo y células necróticas de dicha combinación de líneas celulares de melanoma humano heterólogo, en la que la combinación de líneas celulares está constituida por (a) Mel-XY1 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2831) , (c) Mel-XY3 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2832) , (d) Mel-XX4 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2829) , (e) subpoblaciones de las mismas.

10. Composición según la reivindicación 9, caracterizada porque las células dendríticas maduras presentan el fenotipo CD14-, CD11c+, CD1a+ y CD83+.

11. Procedimiento para la preparación de la composición según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende las etapas que consisten en:

a) descongelar y cultivar las líneas celulares (a) Mel-XY1 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2831) , (c) Mel-XY3 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2832) , (d) Mel-XX4 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2829) ;

b) irradiar dichas líneas celulares;

c) agregar adyuvantes y/o excipientes.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque las células son irradiadas a un valor de 50 a 100 Gy.

13. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el adyuvante es BCG.

14. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el inmunomodulador es seleccionado de entre el grupo que comprende GM-CSF, G-CSF, IFNα, ciclofosfamida y mezclas de los mismos.

15. Procedimiento para preparar la composición según la reivindicación 9, caracterizado porque comprende las etapas que consisten en:

a) descongelar y cultivar las líneas celulares (a) Mel-XY1 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2831) , (c) Mel-XY3 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2832) y (d) Mel-XX4 (depositada en German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2829) ;

b) irradiar dichas líneas celulares;

c) obtener células dendríticas autólogas; y

d) cocultivar durante un tiempo determinado las células dendríticas autólogas con las líneas celulares irradiadas de la etapa b) .

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque las células son irradiadas a un valor de 50 a 100 Gy.

17. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque el cocultivo se lleva a cabo a una temperatura de 35 a 39ºC y durante un periodo de tiempo de 6 a 72 horas.

18. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque en la etapa d) la relación entre células dendríticas autólogas y las líneas celulares es de 1:1 a 3:1.

19. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque las células dendríticas de la etapa d) comprenden células dendríticas inmaduras.

20. Procedimiento según la reivindicación 11 o 15 caracterizado porque comprende una etapa que consiste en mezclar las líneas celulares.

21. Líneas celulares según la reivindicación 1 para preparar una composición para inducir una respuesta inmunitaria antitumoral en mamíferos que presentan melanoma.

22. Líneas celulares según la reivindicación 1, para preparar una composición para el tratamiento de mamíferos que presentan melanoma.

23. Líneas celulares según la reivindicación 1, para preparar una composición para el tratamiento adyuvante de mamíferos que presentan melanoma.