Procedimiento para la selección, cribado, de sangre y/o suero con respecto a anticuerposantigranulocitarios en una extensa población de donantes,

caracterizado porque se emplea una citometría de flujocon inmunofluorescencia de granulocitos, en la que en la que se usa sangre con EDTA de dos donantes tipificadoscon respecto a HNA y se lleva a cabo un aislamiento de células mediante un gradiente de densidad y una lisis desangre completa, sin centrifugación, seguido de una etapa de lavado, después de la cual, para la realización delensayo de inmunofluorescencia de granulocitos, tiene lugar una incubación del material celular aislado con suero,así como una incubación con anticuerpos marcados por fluorescencia y el material celular incubado se somete a unanálisis por citometría de flujo.

Procedimiento para la selección, cribado, de sangre y/o suero con respecto a anticuerpos antigranulocitarios en una extensa población de donantes

Campo técnico

La invención se refiere a un procedimiento para la selección, cribado, de sangre y/o suero con respecto a anticuerpos antigranulocitarios en una extensa población de donantes.

Estado de la técnica

Es sabido que los anticuerpos asociados a leucocitos pueden producir graves reacciones transfusionales en receptores de donaciones de sangre o plasma, en particular en el pulmón (TRALI; véanse: 1. Popovsky MA, Chaplin HC Jr, Moore, SB. Transfusion-related acute lung injur y : a neglected, serious complication of hemotherapy. Transfusion 1992, 32: 589-592; 2. Silliman CC. Transfusion-related acute lung injur y . Transfus Med Rev 1999, 13: 177-186) o a reacciones transfusionales febriles durante la administración de donaciones de sangre o plasma, en particular cuando dichas donaciones contienen anticuerpos HNA-3a específicos contra granulocitos. Algunos estudios analíticos realizados a gran escala han demostrado la importancia de los anticuerpos antigranulocitarios, de modo que debe conocerse su presencia o ausencia en la sangre de los donantes así como en los productos plasmáticos de donantes para excluir en lo posible la administración de donaciones de sangre y/o plasma con anticuerpos antigranulocitarios. Los granulocitos o micrófagos son leucocitos polimorfonucleares que, sin embargo, una vez completamente diferenciados, ya no son capaces de dividirse y que contienen un citoplasma granular.

La patogénesis de la lesión TRALI incluye la infusión de anticuerpos específicos del donante dirigidos contra antígenos, a saber, HLA de clase I o de clase II, o específicos de granulocitos, que pueden estar presentes en los leucocitos del receptor como resultado de activaciones del complemento, de secuestros y de activaciones de neutrófilos (PMN) en el pulmón, lo que puede conducir a una destrucción endotelial y a falta de perfusión capilar, así como a lesiones pulmonares agudas (ALI) . En la mayoría de los casos clínicos de TRALI se encuentran afectados los anticuerpos HLA de clase II y HNA, en particular HNA-3a.

Como procedimientos de diagnóstico de granulocitos para el cribado de sangre y/o plasma para la detección de anticuerpos antigranulocitarios, se conocen el ensayo de aglutinación de granulocitos al microscopio, abreviado GAT, así como el ensayo de inmunofluorescencia de granulocitos al microscopio, abreviado GIFT (véanse: 1. Lalezari P, Jiang A, Lee S: A microagglutination technique for the detection of leucocyte agglutinins; en Ray JG (ed.) : NIAID Manual of Tissue Typing Techniques, NIH Publication, Rockville. National Institutes of Health, 1979, 20-2; 2. Verheugt FW, von dem Borne AE, Décar y F, Engelfriet CP. The detection of granulocyte alloantibodies with an indirect immunofluorescence test. Br J Haematol 1777, 36: 533-44) . Si el ensayo de aglutinación de granulocitos (GAT) o el ensayo de inmunofluorescencia de granulocitos (GIFT) dan resultado positivo, se emplea la técnica MAIGA para la especificación de los anticuerpos detectados.

En los procedimientos conocidos se procede de la manera siguiente: en principio se analiza la sangre con EDTA de al menos tres donantes tipificados con respecto a HNA, llevando a cabo un aislamiento de células mediante un gradiente de densidad. A continuación las muestras se lavan y se realiza una lisis de los eritrocitos residuales y después se repite el lavado. Los procedimientos GIFT y GAT divergen después de estas etapas de lavado.

Con respecto al ensayo de inmunofluorescencia de granulocitos al microscopio, se lleva a cabo una fijación con PFA, así como una etapa de lavado. A continuación tiene lugar una incubación con suero, así como una incubación con anticuerpos marcados por fluorescencia. El resultado se somete a un análisis microscópico. Con respecto al ensayo de aglutinación de granulocitos al microscopio, tiene lugar una incubación con suero y después el resultado se somete a un análisis microscópico. La desventaja de los procedimientos anteriores consiste en que requieren mucho tiempo, necesitándose de cinco a seis horas para la conclusión del análisis microscópico. Además, solo es posible un bajo rendimiento, que va acompañado de un gran consumo de células de prueba debido a grandes pérdidas durante el aislamiento de las mismas. Con los procedimientos conocidos GIFT y GAT no es posible un cribado de sangre o suero en una extensa población de donantes.

Además, se ha dado a conocer una citometría de flujo como procedimiento sensible para la detección de inmunoglobulinas unidas a granulocitos (Veys PA, Gutteridge CN, Macey M, Ord J y col. Detection of granulocyte antibodies using flow cytometric analysis of leucocyte immunofluorescence. Vox Sang 1989, 56: 42-7) . Sin embargo, este procedimiento requiere el aislamiento de los granulocitos, en lo que debe tenerse en cuenta que habrá grandes pérdidas de células.

Por lo tanto, en el estado de la técnica es necesario emplear los procedimientos estándar GIFT y GAT para detectar todos los anticuerpos HNA relevantes, en particular los anticuerpos dirigidos contra HNA-3a, en que la mejor manera de poder detectarlos es mediante el procedimiento GAT (véanse: 1. Bux J, Chapman J: Results of the Second International Granulocyte Serology Workshop. Transfusion, 1997, 37: 977-83; 2. Lucas G, Rogers S, de Haas M y col. Report on the Fourth International Immunology Workshop: progress toward quality assessment. Transfusion, abril de 2002, 42: 462-8) .

Objetivo técnico

La invención se basa en el objetivo de conseguir un procedimiento para la selección, cribado, de sangre y/o plasma con respecto a anticuerpos antigranulocitarios, con el fin de poder analizar rápidamente numerosas muestras de sangre en una extensa población de donantes, en particular en un procedimiento automatizado; asimismo, el procedimiento solamente deberá requerir un consumo reducido de células de prueba. En particular, el procedimiento deberá permitir la detección de aquellos anticuerpos antigranulocitarios que hasta ahora solo podían detectarse mediante la combinación de los procedimientos GIFT y GAT.

Según la invención, la consecución del objetivo consiste en que para la selección, cribado, de sangre y/o suero con respecto a anticuerpos antigranulocitarios en una extensa población de donantes se emplea una citometría de flujo con inmunofluorescencia de granulocitos, en la que se usa sangre con EDTA de dos donantes tipificados con respecto a HNA y se lleva a cabo un aislamiento de células mediante un gradiente de densidad y una lisis de sangre completa, sin centrifugación, seguido una etapa de lavado, después de la cual, para la realización del ensayo de inmunofluorescencia de granulocitos, tiene lugar una incubación del material celular aislado con suero, así como una incubación con anticuerpos marcados por fluorescencia y el material celular incubado se somete a un análisis por citometría de flujo.

En otra configuración de la invención, este análisis por citometría de flujo se realiza en un procedimiento automatizado.

La ventaja del procedimiento según la invención para selección, cribado, de sangre y/o plasma con respecto a anticuerpos antigranulocitarios consiste especialmente en que se pone a disposición un análisis por citometría de flujo mediante el cual pueden analizarse numerosas muestras de sangre de extensas poblaciones de donantes, en particular en un procedimiento automatizado. Al evitar la etapa de centrifugación, el consumo de células de prueba es bajo, ya que especialmente la centrifugación conduce a la destrucción e inutilidad de las células de prueba. Otra ventaja del procedimiento según la invención consiste en que ahora se detectan también aquellos anticuerpos antigranulocitarios que hasta el momento según el estado de la técnica solo podían detectarse con la combinación de los procedimientos GIFT y GAT. Otra ventaja consiste en que el procedimiento según la invención permite realizar rápidamente numerosos análisis sucesivos. Por ejemplo, para 50 análisis se necesitan solamente de tres a un máximo de cuatro horas, mientras que en el estado de la técnica se necesitan de cinco a seis horas para unos pocos análisis.

En otra configuración de la invención, cada población de células se separa por sedimentación al llevar a cabo el gradiente de densidad de Ficoll para el aislamiento de las células, con lo... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la selección, cribado, de sangre y/o suero con respecto a anticuerpos antigranulocitarios en una extensa población de donantes, caracterizado porque se emplea una citometría de flujo con inmunofluorescencia de granulocitos, en la que en la que se usa sangre con EDTA de dos donantes tipificados con respecto a HNA y se lleva a cabo un aislamiento de células mediante un gradiente de densidad y una lisis de sangre completa, sin centrifugación, seguido de una etapa de lavado, después de la cual, para la realización del ensayo de inmunofluorescencia de granulocitos, tiene lugar una incubación del material celular aislado con suero, así como una incubación con anticuerpos marcados por fluorescencia y el material celular incubado se somete a un análisis por citometría de flujo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque cada población de células se separa por sedimentación mediante un gradiente de densidad de Ficoll para el aislamiento de las células.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la sedimentación se facilita mediante sacudidas.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque se prescinde de una fijación de las células.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, caracterizado porque se usa 7-AAD para la identificación de anticuerpos citotóxicos mediante el examen de las células muertas, así como la evaluación simultánea de la fluorescencia unida a las células en monocitos y linfocitos.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ensayo de inmunofluorescencia de granulocitos por citometría de flujo (FLOW GIFT) tiene lugar en un procedimiento automatizado por medio de un robot.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células de prueba se marcan junto con el suero por medio de anticuerpos secundarios marcados por fluorescencia y, a continuación, la luz fluorescente producida por el anticuerpo secundario marcado por fluorescencia se detecta con un detector tras su excitación por un detector láser.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque, para el aislamiento de leucocitos, se añade sangre anticoagulada a un gradiente de densidad de Ficoll, sin una etapa de centrifugación, a continuación, después de un tiempo de espera de 10 a 30 minutos, preferentemente de aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente, tiene lugar una separación automática mediante sedimentación de los leucocitos del sobrenadante de plasma rico en leucocitos, a continuación, los eritrocitos (RBC) remanentes en el sobrenadante se lisan, preferentemente por la adición de cloruro de amonio al 10%, después, las células se lavan, preferentemente en PBS, compuesto de BSA al 0, 2% y Na2-EDTA al 0, 6%, y se resuspenden, preferentemente en PBS, luego tiene lugar una incubación de las células resuspendidas con el suero correspondiente, preferentemente durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 37°C; después sigue, dado el caso, una etapa de lavado, en particular dos etapas de lavado y una incubación, preferentemente con anticuerpos F (ab’) 2 de conejo dirigidos contra IgG humana y marcados con FITC, en lo que, para excluir las células muertas se añade 7-AAD y se espera un tiempo de incubación, preferentemente de aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente, al que sigue, dado el caso, otra etapa de lavado, así como, dado el caso, una resuspensión, preferentemente en PBS con paraformaldehído (PFA) preferentemente a aproximadamente el 0, 1%; finalmente se determina la fluorescencia unida a las células mediante un análisis por citometría de flujo.