Polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido, que abarca la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:

2, realizándose que el L-ácido aspártico en la posición de la secuencia de aminoácidos es reemplazado por L-valina y realizándose que el polipéptido posee una actividad de citrato sintasa.

Procedimiento para la producción de L-aminoácidos mediante mutantes del gen gltt que codifica la citrato sintasa Son objeto del invento unos nuevos polinucleótidos, que codifican un polipéptido con una actividad de citrato sintasa, unas bacterias, que contienen a éstos, y un procedimiento para la producción de aminoácidos mediando utilización de estas bacterias.

Estado de la técnica

Los aminoácidos encuentran utilización en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy especialmente en la nutrición de animales.

Es conocido el hecho de que ciertos aminoácidos pueden ser producidos por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular de Cor y nebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a unas medidas técnicas de fermentación tales como p.ej. las de agitación y abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como p.ej. la concentración de azúcares durante la fermentación, o el tratamiento para dar la forma del producto mediante p.ej. una cromatografía con intercambio de iones o las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas, que son resistentes a unos antimetabolitos o que son auxótrofas para unos metabolitos importantes para regulación y que producen los aminoácidos. Un antimetabolito conocido es el compuesto análogo a lisina S- (2-amino-etil) -L-cisteína (AEC) .

Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas del género Cor y nebacterium que producen L-aminoácidos, en particular de Cor y nebacterium glutamicum, mediante el recurso de que se amplifican unos genes individuales para la biosíntesis de los aminoácidos ramificados, y se investiga la repercusión sobre la producción de aminoácidos.

Unos artículos recopilativos acerca de la biología, la genética y la biotecnología de Cor y nebacterium glutamicum se encuentran en la obra "Handbook of Cor y nebacterium glutamicum" (Manual de Cor y nebacterium glutamicum) (coordinadores de edición: L. Eggeling y M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis, 2005) , en la edición especial del Journal of Biotechnology (coordinador de edición jefe: A. Pühler) con el título "A New Era in Cor y nebacterium glutamicum Biotechnology" (Una nueva era en la biotecnología de Cor y nebacterium glutamicum) (Journal of Biotechnolgy 104/1-3, (2003) ) y en la obra de T. Scheper (coordinador administrativo) "Microbial Production of L-Amino Acids" (Producción microbiana de L-aminoácidos) (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, Editorial Springer, Berlín, Alemania, 2003) .

La secuencia de nucleótidos del genoma de Cor y nebacterium glutamicum ha sido descrita por Ikeda y Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003) ) , en el documento de patente europea EP 1 108 790 y en la cita de Kalinowski y colaboradores (Journal of Biotechnolgy 104/1-3, (2003) ) .

La secuencia de nucleótidos del genoma de Cor y nebacterium efficiens ha sido descrita por Nishio y colaboradores (Genome Research. 13 (7) , 1572-1579 (2003) ) .

Las secuencias de nucleótidos de los genomas de Cor y nebacterium glutamicum y de Cor y nebacterium efficiens son accesibles asimismo en el Banco de Datos del National Center for Biotechnology Information (Centro nacional para información de biotecnología) (NCBI) de la National Librar y of Medicine (Biblioteca nacional de medicina) (Bethesda, MD, EE.UU.) , en el DNA Data Bank of Japan (Banco de datos de ADN de Japón) (DDBJ, Mishima, Japón) o en el Banco de datos de secuencias de nucleótidos de los European Molecular Biologies Laboratories (Laboratorios europeos de biologia molecular) (EMBL, Heidelberg, Alemania o respectivamente Cambridge, Reino Unido) .

La secuencia de tipo silvestre, conocida a partir del estado de la técnica, de la región codificadora del gen gltA de Cor y nebacterium glutamicum se representa en la SEQ ID NO: 1 en la parte descriptiva de la presente solicitud de patente. En las SEQ ID NO: 3 y 25 se representan además de esto las secuencias que están situadas corriente arriba y corriente abajo de la región codificadora. La secuencia de aminoácidos del polipéptido GltA codificado (la citrato sintasa) se reproduce de manera correspondiente en las SEQ ID NO: 2, 4 y 26.

Misión del invento

Los autores del invento se han planteado la misión de poner a disposición unas nuevas medidas técnicas para realizar una mejorada producción de L-aminoácidos, de manera preferida de L-lisina, L-valina y L-isoleucina, de manera especialmente preferida de L-lisina.

Descripción del invento

Un objeto del invento es un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, habiendo sido reemplazado el L-ácido aspártico en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos por L-valina y poseyendo el polipéptido una actividad de citrato sintasa (n° de EC 4.1.3.7) . Eventualmente, el polipéptido contiene uno o varios intercambios conservativos de aminoácidos, permaneciendo la actividad de citrato sintasa del polipéptido esencialmente inalterada por los intercambios conservativos de aminoácidos.

Por el concepto de "aminoácidos proteinógenos" se entienden los aminoácidos, que se presentan en proteínas naturales, es decir en proteínas de microorganismos, plantas, animales y seres humanos. A éstos pertenecen en particular unos L-aminoácidos, escogidos entre el conjunto que se compone de L-ácido aspártico, L-asparagina, Ltreonina, L-serina, L-ácido glutámico, L-glutamina, glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, L-prolina y L-arginina.

Los conceptos de polipéptido y proteína son utilizados como sinónimos.

Además, son un objeto del invento unos vectores y unas bacterias, de manera preferida de los géneros Cor y nebacterium y Escherichia, de manera especialmente preferida de las especies Cor y nebacterium glutamicum y Escherichia coli, que contienen el mencionado polinucleótido o que habían sido producidos mediando utilización del mencionado polinucleótido.

Finalmente, son un objeto del invento unas bacterias, de manera preferida de los géneros Cor y nebacterium y Escherichia, de manera especialmente preferida de las especies Cor y nebacterium glutamicum y Escherichia coli, que han sido transformadas con el mencionado vector.

El concepto de "transformación" abarca todos los métodos para realizar la transferencia de polinucleótidos, en particular de un ADN, a una bacteria deseada. A éstos pertenecen, entre otros, la utilización de un ADN aislado en el caso de la transformación, la electrotransformación o respectivamente la electroporación, la transferencia mediante contacto con las células tal como en el caso de la conjugación o la transferencia de ADN mediante bombardeo con partículas.

Otro aspecto adicional del invento se refiere a una bacteria, en particular a una bacteria recombinante, del género Cor y nebacterium, que contiene un polinucleótido, que codifica un polipéptido con una actividad de citrato sintasa, que abarca la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, estando contenida la L-valina en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos. Eventualmente, el polipéptido contiene uno o varios intercambios conservativos de aminoácidos, permaneciendo la actividad de citrato sintasa del polipéptido esencialmente inalterada por los intercambios conservativos de aminoácidos.

Otro aspecto del invento se refiere a un procedimiento para la producción de L-aminoácidos, de manera preferida de L-lisina, L-valina y L-isoleucina, de manera especialmente preferida de L-lisina, caracterizado porque abarca las siguientes etapas.

a) fermentación de las bacterias recombinantes conformes al invento del género Cor y nebacterium glutamicum en un medio nutritivo adecuado, y b) acumulación del L-aminoácido en el medio nutritivo o en las células de las bacterias.

Por el concepto de "L-aminoácidos" se entienden los aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido, que abarca la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, realizándose que el L-ácido aspártico en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos es reemplazado por L-valina y realizándose que el polipéptido posee una actividad de citrato sintasa.

2. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido contiene desde uno hasta a lo sumo cinco intercambios conservativos de aminoácidos, permaneciendo la actividad de citrato sintasa del polipéptido inalterada en comparación con la actividad de citrato sintasa del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO:6.

3. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1-2, caracterizado porque el polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:5.

4. Polinucleótido aislado, que abarca una secuencia de nucleótidos, que desde la posición1 hasta la 39 contiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 1 hasta 39 de la SEQ ID NO:11, y desde la posición 40 hasta la 105 contiene una secuencia de nucleótidos, que codifica la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:12, estando contenida L-valina en la posición 5, y el polinucleótido es utilizable para la introducción de la mutación en el gen gltA de acuerdo con la SEQ ID NO:1 en el cromosoma mediante un intercambio de alelos.

5. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque él abarca la secuencia de nucleótidos desde la posición 263 hasta la 1.263 de la SEQ ID NO:7.

6. Vector, que contiene un polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 5.

7. Bacteria, que ha sido transformada con el vector de acuerdo con la reivindicación 6.

8. La bacteria de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque se trata de una bacteria del género Cor y nebacterium o Escherichia, de manera preferida de Cor y nebacterium glutamicum o Escherichia coli.

9. Bacteria del género Cor y nebacterium, de manera preferida Cor y nebacterium glutamicum, que contiene un polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 5.

10. Bacteria recombinante del género Cor y nebacterium que contiene un polinucleótido, que codifica un polipéptido con una actividad de citrato sintasa, que abarca la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, estando contenida L-valina en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos.

11. La bacteria recombinante del género Cor y nebacterium de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque el polipéptido contiene desde uno hasta a lo sumo cinco intercambios conservativos de aminoácidos, permaneciendo la actividad de citrato sintasa del polipéptido inalterada en comparación con la actividad de citrato sintasa del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO:6.

12. La bacteria recombinante del género Cor y nebacterium de acuerdo con las reivindicaciones 10 hasta 11, caracterizada porque el polinucleótido posee la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:5.

13. La bacteria recombinante del género Cor y nebacterium de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 hasta 12, caracterizada porque ella contiene un polinucleótido, que codifica un polipéptido con una actividad de aspartato cinasa, que abarca la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20, y que contiene uno o varios de los intercambios de aminoácidos escogidos entre el conjunto que se compone de

a) un intercambio de L-alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-treonina (LysC A279T) , b) un intercambio de L-alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-valina (LysC A279V) , c) un intercambio de L-leucina en la posición 297 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-glutamina (LysC L297Q) , d) un intercambio de L-serina en la posición 301 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-fenilalanina (LysC S301F) , e) un intercambio de L-serina en la posición 301 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-tirosina (LysC S301Y) , f) un intercambio de L-treonina en la posición 308 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-isoleucina (LysC T308I) , g) un intercambio de L-treonina en la posición 311 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-isoleucina (LysC T311I) , h) un intercambio de L-serina en la posición 317 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-alanina (LysC S317A) , i) un intercambio de L-arginina en la posición 320 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por glicina (LysC R320G) , j) un intercambio de glicina en la posición 345 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-ácido aspártico (LysC G345D) , k) un intercambio de L-treonina en la posición 380 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-isoleucina (LysC T380I) , y l) un intercambio de L-serina en la posición 381 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-fenilalanina (lysC S381F) .

14. La bacteria recombinante del género Cor y nebacterium de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizada porque se sobreexpresa el polinucleótido, que codifica un polipéptido con una actividad de aspartato cinasa.

15. La bacteria recombinante del género Cor y nebacterium de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 hasta 14, caracterizada porque ella contiene adicionalmente una o varias de las características, escogidas entre el conjunto que se compone de

a) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica una dihidrodipicolinato sintasa (DapA) , b) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica una aspartatosemialdehído deshidrogenasa (Asd) , c) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica una diaminopimelato descarboxilasa (LysA) , d) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica una asparato aminotransferasa (Aat) , e) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica un polipéptido con una actividad de exportación de Llisina (LysE) , f) una actividad desconectada o debilitada de la malato deshidrogenasa (Mdh) , g) una actividad desconectada o debilitada de la malato-quinona oxidorreductasa (Mqo) , h) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica una piruvato carboxilasa (Pyc) , e i) una actividad desconectada o debilitada de la subunidad E1p del complejo de la piruvato deshidrogenasa (AceE) ) , de manera preferida

contiene todas las características a) hasta g) .

16. La bacteria recombinante del género Cor y nebacterium de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 10 hasta 15, caracterizada porque se trata de Cor y nebacterium glutamicum.

17. Procedimiento para la producción de un L-aminoácido, de manera preferida L-lisina, L-valina o L-isoleucina, de manera especialmente preferida L-lisina, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) fermentación de las bacterias del género Cor y nebacterium de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 hasta 16 en un medio nutritivo adecuado, y b) acumulación del L-aminoácido en el medio nutritivo o en las células de las bacterias mencionadas.

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque se recoge el L-aminoácido y/o porque se aísla y purifica el L-aminoácido.

19. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 17 o 18, caracterizado porque unos componentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa permanecen en su totalidad o en porciones (> 0 a 100 %) en el producto final.

20. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 17 hasta 19, caracterizado porque se trata de un procedimiento por tandas, de un procedimiento de afluencia o de un procedimiento contínuo.

21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque cuando en el caso del L-aminoácido se trate de L-lisina, se substrae agua desde un caldo de fermentación que contiene L-lisina, y se obtiene un producto con un contenido de agua de como máximo 5 % en peso, o porque se concentra primeramente un caldo de fermentación que contiene L-lisina, y a continuación se seca por atomización o se granula por atomización.

22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque cuando en el caso del L-aminoácido se trate de L-lisina, se llevan a cabo las siguientes etapas

a) se disminuye el valor del pH a 4, 0 hasta 5, 2 mediante la adición de ácido sulfúrico, y en el caldo se ajusta una relación molar de sulfato/L-lisina de 0, 85 a 1, 2, eventualmente mediante adición de otros compuestos adicionales que contienen sulfato, en particular de sulfato de amonio y/o hidrógeno-sulfato de amonio o ácido sulfúrico y amoníaco en las correspondientes relaciones y b) la mezcla así obtenida se concentra mediante substracción de agua, y eventualmente se granula.

Figura 1: