Una molecula aislada de acidos nucleicos que comprende una secuencia de polinucleotidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ.

ID. Nos. 9 o 10 o una de sus secuencias complementarias.

Genes procedentes del amplicón 20Q13 y sus usos

5 REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud es una continuacion en parte del documento USSN 08/785.532, presentado el 17 de enero de 1997, del documento USSN 08/731.499 presentado el 16 de octubre de 1996 y del documento USSN 08/680.395 presentado el 15 de julio de 1996, que esta relacionada con la Solicitud de patente copendiente de EE.UU., USSN

08/546.130, presentada el 20 de octubre de 1995.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Esta invencion pertenece al campo de la citogenetica. Mas en particular esta invencion esta relacionada

con la identificacion de genes en una region de amplificacion en 20q13 aproximadamente en diversos tipos de cancer. Los genes descritos en el presente documento se pueden utilizar como sondas especificas para el amplicon 20q13 asi como para el tratamiento de diversos tipos de cancer. [0003] Las anomalias cromosomicas a menudo llevan asociados trastornos geneticos, enfermedades

degenerativas, y cancer. En particular, la eliminacion o multiplicacion de copias de cromosomas completos o segmentos cromosomicos, y niveles superiores de amplificacion de regiones especificas del genoma son eventos frecuentes en cancer. Vease, por ejemplo, Smith, y col., Breast Cancer Res. Treat., 18: Suppl. 1: 5-14 (1991, van de Vijer & Nusse, Biochim. Biophys. Acta. 1072: 33-50 (1991) , Sato, y col., Cancer. Res., 50: 7184-7189 (1990) . De hecho, la amplificacion y eliminacion de secuencias de ADN que contienen proto-oncogenes y genes supresores de

tumores, respectivamente, habitualmente son caracteristicas de la tumorogenesis. Dutrillaux, y col., Cancer Genet. Cytogenet., 49: 203-217 (1990) . Obviamente, la identificacion de regiones amplificadas y eliminadas y la clonacion de los genes involucrados es crucial tanto para el estudio de la tumorogenesis como para el desarrollo del diagnostico del cancer.

La deteccion de regiones cromosomicas amplificadas o eliminadas tradicionalmente se ha realizado mediante citogenetica. Debido al complejo empaquetamiento del ADN dentro de los cromosomas, la resolucion de las tecnicas citogeneticas ha estado limitada a regiones mayores de 10 Mb aproximadamente; aproximadamente la anchura de una banda en cromosomas tefidos con Giemsa. En cariotipos complejos con multiples traslocaciones y otras variaciones geneticas, el analisis citogenetico tradicional es de poca utilidad debido a que se carece de la

informacion del cariotipo o no se puede interpretar. Teyssier, J.R., Cancer Genet. Cyrogenet., 37: 103 (1989) . Ademas, el analisis citogenetico de bandas convencional consume tiempo, requiere mucho trabajo, y con frecuencia resulta dificil o imposible. [0005] Mas recientemente se han utilizado sondas clonadas para valorar mediante transferencia de Southern la

cantidad de una secuencia de ADN dada en un cromosoma. Este procedimiento es eficaz incluso si el genoma se ha reorganizado enormemente para asi eliminar la informacion cariotipica util. No obstante, la transferencia de Southern solamente proporciona una estimacion grosera del numero de copias de una secuencia de ADN, pero no proporciona informacion sobre la localizacion de dicha secuencia dentro del cromosoma.

45 [0006] La hibridacion genomica comparativa (CGH) es un enfoque mas reciente para identificar la presencia y localizacion de secuencias amplificadas/eliminadas. Vease Kallioniemi, y col., Science, 258: 818 (1992) . La CGH, al igual que la transferencia de Southern, revela amplificaciones y eliminaciones independientemente de la reordenacion del genoma. Ademas, la CGH proporciona una estimacion del numero de copias mas cuantitativa que la transferencia de Southern, e incluso tambien proporciona informacion de la localizacion de la secuencia

50 amplificada o eliminada en el cromosoma normal. [0007] Utilizando la CGH, se ha identificado la region 20q13 del cromosoma como una region que se amplifica frecuentemente en canceres (vease, por ejemplo, Kallioniemi y col., Genomics, 20: 125-128 (1994) ) . El analisis inicial de esta region en lineas celulares de cancer de mama ha identificado una region de 2 Mb aproximadamente

55 en el cromosoma 20 que se amplifica de forma consistente. [0008] La Base de datos del EMBL, 8 de mayo de 1996 (numero de acceso a la base de datos del EBI W05407) describe una EST obtenida a partir de tejido humano de pulmon fetal.

La Base de datos del EMBL, 16 de marzo de 1996 (numero de acceso a la base de datos del EBI N70546) describe una EST adicional obtenida a partir de tejido humano de pulmon fetal.

El documento WO 95/09929 A describe secuencias de ADNc procedentes de una region de amplificacion 5 en el cromosoma 20 relacionadas con la enfermedad.

Tanner MM y col. 1995 (Clinical Cancer Research, vol. 1, n° 12, paginas 1455-1461) describe la utilizacion de hibridacion in situ con fluorescencia con una sonda de un cosmido para la region minima de amplificacion (RMC20C001) con el fin de estudiar la amplificacion de 20q13 en 132 carcinomas primarios de mama y 11

metastasis. El tamafo del amplicon se estudio con cuatro sondas flanqueantes.

Tanner y col. 1994 (Cancer Research, vol. 54, numero 16, paginas 4257-4260) describe la utilizacion de hibridacion in situ con fluorescencia en interfase con sondas de cosmidos anonimos y clones P1 especificos para los genes con el fin de determinar la region minima comun de mayor numero de copias y estudiar la implicacion de

genes conocidos en 20q13.

Kallioniemi A y col., 1994 (PNAS, vol. 91, numero 6, paginas 2156-2160) describe la aplicacion de hibridacion genomica comparativa para 5 lineas celulares de cancer de mama y 33 tumores primarios para descubrir y mapear las regiones del genoma con un mayor numero de copias de la secuencia de ADN.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invencion esta relacionada con la identificacion de una region estrecha (600 kb aproximadamente) en el interior de un amplicon de 2 Mb localizado aproximadamente en la region cromosomica 25 20q13 (mas exactamente en 20q13.2) que se amplifica de manera consistente en tumores primarios. Ademas, esta invencion proporciona secuencias de ADNc que mapean en esta region. Estas secuencias son utiles como sondas o como dianas de sondas para controlar el numero de copias relativas de las secuencias correspondientes procedentes de una muestra biologica, tal como una celula tumoral. Tambien se describe un contigo (una serie de clones que extienden de forma contigua este amplicon) que se pueden utilizar para preparar sondas especificas

para el amplicon. Las sondas se pueden utilizar para detectar anomalias cromosomicas en 20q13.

Asi, la presente invencion proporciona una molecula de acidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de polinucleotidos que contiene una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9

o 10 o una de sus secuencias complementarias. En algunas formas de realizacion el acido nucleico aislado es una 35 molecula de ADNc.

En algunas formas de realizacion la secuencia de polinucleotidos comprende las SEQ. ID. Nos. 9 o 10.

En algunas formas de realizacion, el acido nucleico aislado comprende adicionalmente una secuencia 40 promotora unida de manera operable a la secuencia de polinucleotidos.

La invencion tambien proporciona un procedimiento de seleccion de celulas neoplasicas en una muestra, el procedimiento que comprende:

45 la puesta en contacto de una muestra de acidos nucleicos procedente de un paciente humano con un acido nucleico aislado que se hibrida selectivamente a una secuencia de polinucleotidos diana que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 o una de sus secuencias complementarias, o a una subsecuencia de cualquiera de estas susodichas secuencias en donde el acido nucleico aislado se pone en contacto con la muestra en condiciones en las que el acido nucleico aislado se hibrida selectivamente con la secuencia de

50 polinucleotidos diana para formar un complejo de hibridacion estable; y

la deteccion de la formacion de un complejo de hibridacion para controlar el numero de copias relativas de secuencias correspondientes a las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 en la muestra.

55 [0019] En algunas formas de realizacion, la muestra de acidos nucleicos... [Seguir leyendo]

1. Una molecula aislada de acidos nucleicos que comprende una secuencia de polinucleotidos que

comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 o una de sus secuencias 5 complementarias.

2. El acido nucleico aislado de la reivindicacion 1, en el que la secuencia de polinucleotidos comprende las SEQ. ID. Nos. 9 o 10.

10 3. El acido nucleico aislado de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente una secuencia promotora unida de manera operable a la secuencia de polinucleotidos.

4. El acido nucleico aislado de la reivindicacion 1, que es una molecula de ADNc.

15 5. Un procedimiento de seleccion para celulas neoplasicas en una muestra, el procedimiento que comprende:

la puesta en contacto de una muestra de acidos nucleicos procedente de un paciente humano con un acido nucleico aislado que se hibrida selectivamente a una secuencia de polinucleotidos diana que comprende una secuencia

seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 o una de sus secuencias complementarias, o a una subsecuencia de cualquiera de estas susodichas secuencias en las que el acido nucleico aislado se pone en contacto con la muestra en condiciones en las que el acido nucleico aislado se hibrida selectivamente con la secuencia de polinucleotidos diana para formar un complejo de hibridacion estable, y

detectar la formacion de un complejo de hibridacion para controlar el numero de copias relativo de secuencias correspondientes a las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 en la muestra.

6. El procedimiento de la reivindicacion 5, en el que la muestra de acidos nucleicos procede de un

paciente con un cancer seleccionado del grupo constituido por cancer de ovario, vejiga, cabeza y cuello, colon y 30 mama.

7. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6 en el que el acido nucleico aislado esta marcado.

8. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6 en el que el acido nucleico aislado esta inmovilizado sobre una superficie solida.

9. El procedimiento de la reivindicacion 5, en el que la muestra de acidos nucleicos es un nucleo en

propagacion durante la metafase o un nucleo en interfase. 40

10. Un procedimiento de seleccion para celulas neoplasicas en una muestra, el procedimiento que comprende:

la puesta en contacto de una muestra de acidos nucleicos procedente de un paciente humano con un acido nucleico

45 aislado que se hibrida selectivamente a una secuencia de polinucleotidos diana que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 o una de sus secuencias complementarias, o a una subsecuencia de cualquiera de estas susodichas secuencias en las que el acido nucleico aislado se pone en contacto con la muestra en condiciones en las que el acido nucleico aislado se hibrida selectivamente con la secuencia de polinucleotidos diana para formar un complejo de hibridacion estable, y

50 detectar la formacion de un complejo de hibridacion para identificar la presencia de una mutacion en la secuencia de polinucleotidos diana.

11. Un procedimiento para la deteccion de celulas neoplasicas en una muestra biologica, dicho

55 procedimiento que comprende la seleccion de la muestra para la sobre-expresion del gen ZABC1, en donde la sobre-expresion del gen ZABC1 con respecto al tejido normal, es indicativa de una celula neoplasica,

en donde el gen ZABC1 corresponde a cualquiera de las SEQ. ID. Nos. 9 o 10.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que la seleccion de la muestra para la sobre-expresion del gen ZABC1 comprende la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une especificamente a un antigeno polipeptidico codificado por una secuencia de polinucleotidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 y la deteccion de la formacion de un

complejo antigeno-anticuerpo.

13. El procedimiento de la reivindicacion 11 o 12, en el que la muestra se selecciona del grupo constituido por tejido de ovario, vejiga, cabeza y cuello, colon y mama.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, dicho procedimiento que comprende la seleccion de la muestra para la sobre-expresion de una proteina codificada por una secuencia de polinucleotidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10.

15. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 u 11 a 14 para su utilizacion en

el diagnostico de la aparicion o progresion de un cancer en un individuo del que se ha derivado la muestra biologica, en el que una sobre-expresion de 3 veces o superior del gen ZABC1 en la muestra biologica esta correlacionada con una disminucion de la supervivencia libre de enfermedad en sujetos con ganglios negativos.

16. Un procedimiento para diagnosticar la aparicion o progresion del cancer en un individuo, 20 procedimiento que comprende las etapas de:

(a) determinacion de la expresion del gen ZABC1 en una muestra biologica procedente del individuo, y

(b) comparar el nivel de expresion del gen ZABC1 observado en la muestra biologica con el nivel de expresion del 25 gen ZABC1 derivado de una segunda muestra de tejido clinicamente normal,

en el que una sobre-expresion de 3 veces o superior del gen ZABC1 en la muestra biologica esta correlacionada con una disminucion de la supervivencia libre de enfermedad en sujetos con ganglios negativos.