FRUCTUFURANOSIDASA MEJORADA GENÉTICAMENTE PARA LA OBTENCIÓN DEL PREBIÓTICO 6-KESTOSA.
Fructofuranosidasa mejorada genéticamente para la obtención del prebiótico 6-kestosa.
La presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica derivada de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición 232. Asimismo, la presente invención se refiere al uso de dicha secuencia nucleotídica, al uso del vector de expresión, al uso del producto de expresión o al uso de la célula, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión. Preferiblemente el sistema heterólogo se expresa en Saccharomyces cerevisiae. Además, la presente invención se refiere a un método para la obtención de dicho producto enzimático, al producto enzimático con actividad fructofuranosidasa obtenible por dicho método. Preferiblemente dicho producto enzimático es capaz de producir fructooligosacáridos como por ejemplo 6-kestosa y 1-kestosa.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200930929.
Solicitante: UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID.
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: FERNANDEZ LOBATO,MARIA, ALVARO BENITO,MIGUEL.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/56 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima.
- C12N9/24 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2).
PDF original: ES-2359545_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Fructofuranosidasa mejorada genéticamente para la obtención del prebiótico 6-kestosa.
La presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica derivada de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición 232. Asimismo, la presente invención se refiere a un vector que comprende dicha secuencia nucleotídica, al producto de expresión de dicha secuencia nucleotídica o a la célula que los comprende en cualquiera de sus combinaciones. Por otra parte, la presente invención se refiere al uso de dicha secuencia nucleotídica, al uso del vector de expresión, al uso del producto de expresión o al uso de la célula, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión. Preferiblemente el sistema heterólogo se expresa en Saccharomyces cerevisiae. Además, la presente invención se refiere a un método para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa. Por último la presente invención se refiere al producto enzimático con actividad fructofuranosidasa obtenible por dicho método así como a un método para la obtención de oligosacáridos. Preferiblemente dicho producto enzimático es capaz de producir fructooligosacáridos. Más preferiblemente, los fructooligosacáridos tienen enlaces β-1,2, y β-2,6 y aún más preferiblemente, son 6-kestosa y 1-kestosa.
Estado de la técnica anterior
Las moléculas prebióticas líderes en el mercado europeo son los fructooligosacáridos (FOS) (Sangeetha et al., 2005. Trends Food Sci. Technol. 16: 442-457). Los FOS, resisten la digestión en la parte superior del tracto intestinal, se metabolizan por las bacterias endógenas del colon y estimulan su crecimiento (Rao, 1998. J. Nutr. 80: 1442S-1445S). Los efectos de estas moléculas sobre la persona que los consume son muy variados: reducción de los episodios de diarreas causadas por rotavirus; mejora de los síntomas de la intolerancia a la lactosa; control del estreñimiento por aumento de la masa fecal; aumento de la absorción de calcio, y en consecuencia una reducción del riesgo de osteoporosis; disminución de la capacidad mutagénica de ciertas enzimas microbianas como la nitro-reductasa, asociadas con el cáncer de colon; posible reducción de enfermedades relacionadas con dislipemias, etc.
Los FOS que se comercializan actualmente pertenecen a la serie 1F, están formados por moléculas de fructosa unidas por enlaces β,2-1, con una molécula de glucosa en un extremo (Yun, 1996. Enzyme Microb. Technol., 19: 107-117); se abrevian como GFn, donde n está por lo general comprendido entre 2 y 4 unidades de fructosa (1-kestosa, nistosa y fructosilnistosa). Hay interés industrial en la búsqueda de nuevos FOS con actividad prebiótica mejorada. Los fructooligosacáridos de la serie 6F, consisten en moléculas de fructosa unidas por enlaces β,2-6, con una molécula de glucosa en el extremo no reductor. Generalmente se obtienen mediante hidrólisis ácida a partir del polímero levano. Por vía sintética, se ha descrito la formación de FOS de la serie 6F como producto minoritario en la formación de 1-kestosa a partir de la levansacarasa de Zymomonas mobilis (M. Bekers et al., 2002. Process Biochem., 38: 701-706).
Es conocido que el uso de una fructofuranosidasa de la levadura Schwanniomyces occidentalis (también conocida como Debaryomyces occidentalis) para la producción de FOS, que produce principalmente 6-kestosa, y 1-kestosa como producto secundario (WO/2007/074187). Utilizando como sustrato sacarosa a 600 g L-1 se obtuvo un nivel de producción máximo de FOS a las 24 h de reacción, y fue de 101 g L-1 de los 76 g L-1 son 6-kestosa, con una conversión total de sacarosa del 64%, (Álvaro-Benito et al., 2007. J. Biotechnol., 132(1): 75-81).
Por tanto, a pesar ser conocidos métodos de producción de oligosacáridos prebióticos, debido a la importancia industrial de los mismos, la mejora de su producción, mediante un proceso eficaz y viable industrialmente, es un aspecto pendiente de resolver en la actualidad.
Explicación de la invención
La presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica derivada de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición 232. Asimismo, la presente invención se refiere a un vector que comprende dicha secuencia nucleotídica, al producto de expresión de dicha secuencia nucleotídica o a la célula que los comprende en cualquiera de sus combinaciones. Por otra parte, la presente invención se refiere al uso de dicha secuencia nucleotídica, al uso del vector de expresión, al uso del producto de expresión o al uso de la célula, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión. Preferiblemente el sistema heterólogo se expresa en Saccharomyces cerevisiae. Además, la presente invención se refiere a un método para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa. Por último la presente invención se refiere al producto enzimático con actividad fructofuranosidasa obtenible por dicho método así como a un método para la obtención de oligosacáridos. Preferiblemente dicho producto enzimático es capaz de producir fructooligosacáridos. Más preferiblemente, los fructooligosacáridos tienen enlaces β-1,2, y β-2,6 y aún más preferiblemente, son 6-kestosa y 1-kestosa. El producto enzimático de la presente invención presenta una alta actividad específica, siendo candidatos idóneos para generar 6-kestosa como principal producto de transglicosilación.
La presente invención se encuadra dentro del campo de la industria biotecnológica y, en particular, en el sector agroalimentario dedicado a la obtención de oligosacáridos prebióticos para ser utilizados como ingredientes funcionales en productos dietéticos, productos lácteos, alimentos infantiles y alimentos para animales. También se relaciona con el campo de la industria farmacéutica y cosmética.
En la presente invención, los productos enzimáticos nuevos producen aproximadamente 6 veces más 6-kestosa que la proteína nativa (sin modificar) en las mismas condiciones. Este aumento se relaciona con la modificación de la posición 196 de la proteína nativa (cuyo código genético no es el estándar), donde se sustituye el aminoácido Serina por Leucina (S196L) y con la sustitución de la posición Asparragina 52 por Serina (N52S) y Prolina 232 por Valina (P232V). Es decir, debido a la lectura del código genético del microorganismo S. occidentalis, en la posición 196 de dicha secuencia aminoacídica, hay una Serina. Cuando la secuencia nucleotídica que codifica para esta secuencia aminoacídica, procedente de S. occidentalis, se expresa en un sistema heterólogo que interpreta el código genético estándar, se inserta una Leucina en la posición 196 en el proceso de traducción. Esta secuencia con Leucina en la posición 196 es la que ha sido citada en el documento de patente WO/2007/074187. En la presente invención se demuestra que dicha secuencia con una Leu en la posición 196 es mucho más efectiva en la producción de 6-kestosa que una secuencia que tiene Serina en dicha posición (al igual que en la proteína nativa) cuando son expresadas ambas en un sistema heterólogo de expresión. Además, la sustitución del aminoácido Asparragina en la posición 52 por Serina (N52S) y la sustitución de Prolina en la posición 232 por Valina (P232V), en la secuencia que tiene una Leucina en la posición 196, mejora significativamente la eficacia en la producción del prebiótico 6-kestosa.
Por tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica derivada de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica derivada de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición 232.
2. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 2.
3. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 2, donde dicha secuencia nucleotídica, que codifica para SEQ ID NO: 2, es SEQ ID NO: 3.
4. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 4.
5. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 4, donde dicha secuencia nucleotídica, que codifica para SEQ ID NO: 4, es SEQ ID NO: 5.
6. Vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Producto de expresión de la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o del vector de expresión según la reivindicación 6.
8. Célula que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el vector de expresión según la reivindicación 6, el producto de expresión según la reivindicación 7, o cualquiera de sus combinaciones.
9. Uso de la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión.
10. Uso del vector de expresión según la reivindicación 6, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión.
11. Uso de la célula según la reivindicación 7, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión.
12. Uso del producto de expresión según la reivindicación 8, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde el sistema heterólogo expresa dicha secuencia nucleotídica en Saccharomyces cerevisiae.
14. Método para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa que comprende:
15. Método según la reivindicación 14, donde además comprende:
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 2.
17. Método según la reivindicación 16, donde dicha secuencia nucleotídica, que codifica para SEQ ID NO: 2, es SEQ ID NO: 3.
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 4.
19. Método según la reivindicación 14, donde dicha secuencia nucleotídica, que codifica para SEQ ID NO: 4, es SEQ ID NO: 5.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde el microorganismo que pertenece a una especie diferente de Schwanniomyces occidentalis es Saccharomyces cerevisiae.
21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, donde el cultivo de la célula según el paso (c) se lleva a cabo a una temperatura de entre 28 y 30ºC.
22. Producto enzimático con actividad fructofuranosidasa obtenible por el método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21.
23. Producto enzimático según la reivindicación 22, donde dicho producto tiene actividad transfructosidasa en presencia de uno o varios sustratos glucídicos.
24. Producto enzimático según la reivindicación 23, donde los productos resultantes de la actividad transfructosidasa son fructooligosacáridos.
25. Producto enzimático según la reivindicación 24, donde los fructooligosacáridos tienen enlaces β-1,2, y β-2,6.
26. Producto enzimático según la reivindicación 25, donde los productos son 6-kestosa y 1-kestosa.
27. Método para la obtención de oligosacáridos que comprende:
28. Método para la obtención de oligosacáridos según la reivindicación 27, que además comprende:
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