Adhesina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las siguientessecuencias

a.

grupo DraE como se muestra en la Figura 5

b. DraE/ AfaE-III como se muestra en la Figura 6

c. DraE como se muestra en la Figura 1

donde la adhesina tiene una o más de las siguientes mutaciones y puede tener una eliminación N-terminal de hasta18, preferiblemente hasta 12, 10 o 5, y/o C-terminal de hasta 10, preferiblemente hasta 8 o 5 aminoácidos:

T7(N, F, C, S, V, R, A, I, L, Y); E17 (S, P, K, G,

D, R, N, H, Q); R22(T, A, S, N, K); D25(S, G, N,

A, T, K, R, H, Q, M); T27(K, R, L, V, Y, P, N, Q);

V28(W, F); A29(K, R, S, E, Q, F, G, L, H, P, N,

T, W); T31(G, D, S, N); Q34(D, G, S, N, L, V, T,

A); D37N; A38(S, T, L); A39(Q, S, D, M, G, F);

I41(V); Q47(T, N, C, S, G, A, P); D52(G, N, S,

C, P, Q, Y, H, K, R, T); N84(D, S, H); R86V; T88

(M, L); T95(L, M, Y, F, C, W, Q, N, E, S, I, H);

F100(Y, V); V105(S, A, T, R, M, V, P, N, E, Q,

G, K, H); I111(C, V, H, Y, T, M, F) I114(V, L, A,

C); Y115(T, W, E, V); V116(A, S, L); G118(P, S),

donde la adhesina tiene por lo menos una más de las mutaciones anteriormente mencionadas, si están presenteslas mutaciones T88M y/o N77K.

Fragmentos de adhesina optimizados y nanopartículas correspondientes.

La invención se refiere a adhesinas optimizadas y nanopartículas a las que se unen dichas adhesinas. La invención se refiere además a proporcionar dichas nanopartículas mediante agentes de contraste in vivo, en particular para el diagnóstico de cáncer de intestino.

Para muchas enfermedades, un diagnóstico que sea lo más precoz y significativo posible es de crucial importancia a fin de elegir, coordinar y tomar las medidas médicas necesarias. Esto es especialmente cierto para muchas clases de tumores, para la determinación y para la terapia de la cual (incluyendo posibles secciones) es esencial discriminar tejidos sanos y cancerígenos. Por consiguiente, la recuperación o incluso la supervivencia de un paciente dependen de manera crucial de si el médico a cargo del tratamiento y/o la cirugía es capaz de distinguir diferentes tipos de tejidos, y en qué grado es capaz de distinguirlos.

Para mejorar el diagnóstico y las medidas médicas, se han desarrollado en el pasado agentes de contraste que pueden ayudar a visualizar funciones y estructuras corporales mediante procedimientos por imágenes. Estos procedimientos se utilizan, entre otros, para detectar específicamente alteraciones celulares asociadas a cáncer.

El documento WO 2007/057182 A3, por ejemplo, describe nanopartículas fluorescentes que comprenden por lo menos tres estructuras, a saber, un núcleo inorgánico recubierto con una capa de pasivación que a su vez porta ligandos específicos. Estos ligandos permiten que dicha nanopartícula se una específicamente a una diana. Dicha diana puede consistir específicamente en moléculas superficiales específicas de las células diana, por ejemplo antígenos asociados a tumores.

Las nanopartículas con núcleo y capa de pasivación circundante, que se describen en esta publicación impresa, tienen, un diámetro hidrodinámico pequeño que preferiblemente oscila entre 5 y 15 nm. Las nanopartículas de este tamaño pueden iluminarse mediante los riñones y por lo tanto no se acumulan en el cuerpo o lo hacen solamente encantidades tolerables. Éste es uno de los requisitos importantes para usar nanopartículas para propósitos médicos.

Otro requisito es la gran especificidad de los ligandos unidos a las nanopartículas que reconocen la estructura diana seleccionada en el cuerpo. Solamente un reconocimiento altamente específico permite la detección que es el propósito principal del uso médico de un agente de contraste. Estos ligandos altamente específicos deben al mismo tiempo ser muy pequeños como para no impedir la buena distribución y penetración de las nanopartículas. Los ligandos específicos frecuentemente empleados, tales como los anticuerpos o fragmentos Fab por lo general son demasiado grandes para satisfacer este requisito.

El número de nuevos casos de cáncer de intestino en países industrializados ha aumentado significativamente en los últimos 30 años. Con una incidencia anual de nuevos casos de 30-35 cada 100 000 habitantes, el cáncer de intestino es uno de los tipos de cáncer más frecuentes en Europa Central, y es responsable de aproximadamente 15% de todas las muertes por cáncer. Se estima que la incidencia mundial es de un millón de casos por año. Los hombres se ven ligeramente más afectados que las mujeres, especialmente con carcinomas rectales (relación de sexo 60:40) .

En Alemania, el cáncer de intestino es la segunda forma más frecuente de cáncer, tanto con nuevos casos como con letalidad por cáncer en hombres y mujeres, y más de 20 000 personas murieron en 2005. La “Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister [Sociedad de registros epidemiológicos de cáncer]” incluso asume que hay casi 30 000 casos de letalidad por año.

Cáncer de intestino hace referencia a cualquier tumor maligno de los intestinos. Pueden ser carcinoides, especialmente en el apéndice y el intestino delgado, leiomiosarcom y tumores estromales gastrointestinales (GIST) que derivan del músculo liso y/o el tejido conjuntivo de la mucosa intestinal. No obstante, estas enfermedades son bastante infrecuentes y representan solamente una pequeña proporción de todos los casos de cáncer de intestino. La proporción más grande de casos de cáncer de intestino (más de 95%) está representada por adenocarcinoma del ciego, colon o recto, para los cuales se utiliza también el término genérico cáncer colorrectal.

El cáncer de intestino, especialmente los carcinomas colorrectales, rara vez causan síntomas inicialmente y casi siempre surgen de pólipos intestinales inicialmente benignos. Las probabilidades de cura con cirugía y quimioterapia subsiguiente con un índice de supervivencia de 5 años, en promedio, de 40 a 60%, dependen crucialmente del estadio en el que se diagnostica el cáncer de intestino. Los cuidados preventivos como también el diagnóstico precoz son, por lo tanto, de particular importancia. Este último sería posible mediante la detección temprana de células intestinales cancerosas, en particular CRC (células colorrectales cancerosas) .

La detección de las CRC requiere una diana que sea específica para dichas células y, si es posible, se sobrexprese en el tumor. Se describe que los miembros de la familia CEACAM (molécula de adhesión celular relacionada con CEA; CEA = antígeno carcinoembrionario) tienen aumento de la expresión en células CRC. Los miembros de la familia CEACAM son en consecuencia particularmente adecuados como dianas para la detección de CRC. Incluyen especialmente CEA (CEACAM5) y NCA (CEACAM6) .

La familia CEACAM es un miembro de la superfamilia de Ig. Cada miembro de la familia está altamente glucosilado y consiste en un dominio de tipo variable de Ig N-terminal, en dirección 3’ del cual hay hasta 6 dominios IgC2. CEACAM1, CEACAM3 y CEACAM4 se insertan mediante un dominio transmembrana carboxi-terminal y dominio citoplásmico en la membrana celular, mientras que CEA (CEACAM5) , CEACAM6 (NCA) , CEACAM7 y CEACAM8 se anclan mediante glucosilfosfatidilinositol (GPI) en la membrana. El dominio N-terminal dentro de este grupo tiene más de 90% de similitud en el nivel de los aminoácidos.

CEA y NCA están presentes en el epitelio cilíndrico y en las células caliciformes en tejido de colon. Están ubicados en la superficie apical de enterocitos maduros, es decir, en la región glucocálix/de microvellosidades. CEACAM actúa como moléculas de adhesión intercelular. Esta localización estrictamente apical de CEACAM en células epiteliales de colon normal se ha abandonado en células de adenocarcinoma– las proteínas se expresan por lo tanto en toda la superficie celular. La organización celular y la polaridad celular se han anulado en las células CRC y, en consecuencia, por ejemplo, CEA y/o NCA pueden hallarse en toda la superficie celular. Puede liberarse CEA, ingresando así en el torrente circulatorio, y detectarse como marcador de tumor sérico.

Los ligandos que han sido descritos para estos receptores son, entre otros, adhesinas de la familia Dr de la bacteria

E. coli (adhesinas Afa/Dr, subfamilia DrCEA) . Estas adhesinas se localizan en la superficie bacteriana, parcialmente organizadas en la fimbria de cepas de E. coli que se adhieren en forma difusa (DAEC) y median su adhesión a las células epiteliales. Los miembros de esta familia son AfaE-I, AfaE-III, AfaE-V, DraE y DaaE, por ejemplo.

Los genes de ensamblaje estructural que codifican las adhesinas Afa/Dr tienen una organización similar. Consisten en operones que comprenden por lo menos 5 genes (A a E) . Los genes A a D codifican aquí genes accesorios, donde el gen D codifica una invasina. El gen E codifica la adhesina real.

Las acumulaciones de genes tienen regiones altamente conservadas, por ejemplo los genes afaA, afaB, afaC, afaD y afaF, tienen función reguladora o de chaperones, por ejemplo. El gen estructural que codifica AfaE es muy heterogéneo, produciendo adhesinas antigénicamente distintas.

Las bacterias de E. coli que expresan estos miembros de la familia Afa/Dr de adhesinas se adhieren a células CHO que expresan CEA (Berger et al., Molecular Microbiology, (2004) 52 (4) , pág. 963-983, “Differential recognition of members of the carcinoembr y onic antigen family by Afa/Dr adhesins of diffusely adhering Escherichia coli (Afa/Dr DAEC) ”) . Asimismo, las adhesinas también se describen en Alain L. Servin (Clinical Microbiology Reviews (Abril 2005) 18 (2) , pág.... [Seguir leyendo]

1. Adhesina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las siguientes secuencias

a. grupo DraE como se muestra en la Figura 5

b. DraE/AfaE-III como se muestra en la Figura 6

c. DraE como se muestra en la Figura 1

donde la adhesina tiene una o más de las siguientes mutaciones y puede tener una eliminación N-terminal de hasta 18, preferiblemente hasta 12, 10 o 5, y/o C-terminal de hasta 10, preferiblemente hasta 8 o 5 aminoácidos: T7 (N, F, C, S, V, R, A, I, L, Y) ; E17 (S, P, K, G, D, R, N, H, Q) ; R22 (T, A, S, N, K) ; D25 (S, G, N, A, T, K, R, H, Q, M) ; T27 (K, R, L, V, Y, P, N, Q) ; V28 (W, F) ; A29 (K, R, S, E, Q, F, G, L, H, P, N, T, W) ; T31 (G, D, S, N) ; Q34 (D, G, S, N, L, V, T, A) ; D37N; A38 (S, T, L) ; A39 (Q, S, D, M, G, F) ; I41 (V) ; Q47 (T, N, C, S, G, A, P) ; D52 (G, N, S, C, P, Q, Y, H, K, R, T) ; N84 (D, S, H) ; R86V; T88 (M, L) ; T95 (L, M, Y, F, C, W, Q, N, E, S, I, H) ; F100 (Y, V) ; V105 (S, A, T, R, M, V, P, N, E, Q, G, K, H) ; I111 (C, V, H, Y, T, M, F) I114 (V, L, A, C) ; Y115 (T, W, E, V) ; V116 (A, S, L) ; G118 (P, S) , donde la adhesina tiene por lo menos una más de las mutaciones anteriormente mencionadas, si están presentes

las mutaciones T88M y/o N77K.

2. La adhesina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque es capaz de unirse a la secuencia Nterminal de una proteína de unión que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de las siguientes secuencias

a. CEA/NCA (secuencia de la Fig. 9)

b. CEA (secuencia de la Fig. 10) y/o NCA (secuencia de la Fig. 11) .

3. La adhesina de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque la adhesina tiene una afinidad hacia la proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 2, en particular hacia la secuencia N-terminal de CEA, que está mejorada en por lo menos 5%, preferiblemente en por lo menos 100%, en particular por lo menos 300% o 500% en comparación con aquella de tipo natural.

4. La adhesina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque tiene una o más de las siguientes mutaciones:

V28W; V28F; A39Q; A39S; I41L; Q47S; Q47T; I85L; G118S and T123I.

5. La adhesina que tiene una secuencia de acuerdo con la Fig. 15.

6. Nanopartícula, conjugada a una adhesina de acuerdo con una o más de las reivindicaciones anteriormente expuestas.

7. Nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque tiene un núcleo inorgánico y una capa de pasivación, donde el diámetro más pequeño del núcleo inorgánico junto con la capa de pasivación no tiene más de 15 nm, preferiblemente no más de 10 nm, especial y preferiblemente no más de 5 nm.

8. Nanopartícula de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 6 o 7, caracterizada porque la nanopartícula no es inerte.

9. El uso de la adhesina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o de la nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para la preparación de un agente de contraste para uso médico.

10. El uso de la adhesina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o de la nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para la preparación de un agente de contraste para identificar cáncer de intestino, en particular células CRC.

Fig. 1, SEC. ID Núm. 1.

Fig. 3, SEC ID Núm. 2

Fig. 5, SEC ID Núm. 3

Fig. 6, SEC ID Núm. 4

Fig. 7, SEC ID Núm. 5

Fig. 9, SEC ID Núm. 6

Fig. 10, SEC ID Núm. 7

Fig. 11, SEC ID Núm. 8

Fig. 12

Fig. 13

Fig. 14

Fig. 15, SEC ID Núm. 12