Formulación de esmalte con amelogenina.

Una formulación farmacéutica y/o terapéutica para administrar una sustancia del esmalte activa,

que comprendeuna matriz polimérica y una sustancia del esmalte activa, que comprende al menos un fragmento de amelogenina,donde la concentración de dicha sustancia del esmalte activa es aproximadamente 1 mg/ml de formulación, omenos.

Formulación de esmalte con amelogenina CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a una nueva y mejorada formulación de baja concentración de una sustancia del esmalte activa, tal como una matriz del esmalte, derivado de la matriz del esmalte y/o una proteína de la matriz del esmalte que comprende al menos un fragmento de amelogenina, destinada a usarse como una formulación farmacéutica o terapéutica. En la presente invención, dicha sustancia del esmalte activa se incorpora a la matriz polimérica, en particular destinada para usar en reparación, regeneración y/o remodelado tisular, para inducir la unión entre partes de tejido mineralizado vivo, para unir una pieza de tejido mineralizado vivo a un sitio de unión sobre una pieza de otro tejido vivo, para mejorar la curación de una herida en la piel o mucosa, para prevenir o tratar una infección o una enfermedad inflamatoria, para la formación o regeneración de dentina, para favorecer la toma de un injerto, para tratar neoplasmas benignos derivados epitelialmente, semi-malignos o malignos, para la inducción de apoptosis, o para rellenar una cavidad de herida y/o un defecto tisular después de un procedimiento y/o trauma, tal como cirugía citorreductora.

En la presente invención, la sustancia del esmalte activa que comprende al menos un fragmento de amelogenina se puede incorporar a la matriz polimérica de manera que se libera por degradación de la matriz polimérica por acción enzimática y/o por difusión. Dicha matriz polimérica es adecuada para crecimiento interno celular, u oclusión de células.

Por tanto la invención comprende en particular una formulación farmacéutica o terapéutica de una sustancia del esmalte activa que comprende al menos un fragmento de amelogenina a una concentración total inferior en la formulación, donde una regulación espacial y/o selectiva de liberación de dicha sustancia del esmalte activa permite que se libere un mayor porcentaje de la sustancia del esmalte activa en el momento de la apropiada actividad celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Las sustancias del esmalte activas de la presente invención (la expresión “una sustancia del esmalte activa” se usa en el presente contexto para una matriz del esmalte, un derivado de la matriz del esmalte y/o una proteína de la matriz del esmalte que comprenden al menos un fragmento de amelogenina) , pueden inducir no solamente uno, sino una cascada organizada de factores, encontrados naturalmente en tejidos que se desarrollan adyacentes a la matriz del esmalte. Mimetizan el medio natural de un tejido en desarrollo y por tanto mimetizan un estímulo natural para la regeneración tisular, diferenciación y/o maduración celular.

Las proteínas de la matriz del esmalte, presentes en la matriz del esmalte, son la mayor parte muy conocidas como precursoras del esmalte. Antes de la formación del cemento, las proteínas de la matriz del esmalte se depositan sobre la superficie de la raíz en el extremo apical de la raíz dental en desarrollo. Hay evidencia de que la matriz del esmalte depositada es el factor iniciador para la formación de cemento. Nuevamente, la formación de cemento en sí misma está asociada al desarrollo del ligamento periodontal y hueso alveolar. Como se ha demostrado por los presentes inventores antes de la presente invención, las proteínas de la matriz del esmalte pueden, por tanto, potenciar la regeneración periodontal mediante la imitación del desarrollo de la fijación natural en el diente (Gestrelius S, Lyngstadaas SP, Hammarstrøm L. Regeneración periodontal con Emdogain basada en el biomimetismo. Clin Oral Invest 4:120-125 (2000) ) .

La matriz del esmalte está compuesta por un número de proteínas, tales como amelogeninas, enamelina, proteína de penachos del esmalte, proteasas, y albúmina. Las amelogeninas, el constituyente mayoritario de la matriz del esmalte, son una familia de proteínas hidrofóbicas derivadas de un solo gen mediante corte y empalme alternativo y proceso post-secretor controlado. Están muy conservadas a lo largo de la evolución de los vertebrados y presentan un alto nivel de homología secuencial entre todos los vertebrados superiores examinados (aproximadamente 80%) . De hecho, las secuencias del gen transcrito de amelogenina de porcino y humana difieren solamente en 4% de las bases, Por tanto, las proteínas de la matriz del esmalte, aunque de origen porcino, se consideran “propias” cuando se encuentran en el cuerpo humano y pueden potenciar la regeneración dental en humanos sin desencadenar respuestas alérgicas u otras reacciones no deseadas.

Los derivados de la matriz del esmalte (por ejemplo EMD) , en forma de un purificado extracto ácido de proteínas de la matriz del esmalte de porcino, se han usado previamente con éxito para restablecer el ligamento periodontal funcional, cemento y hueso alveolar en pacientes con grave pérdida de fijación dental (Hammarström et al., 1997, Journal of Clinical Periodontology 24, 658-668) .

Además, en estudios sobre células del ligamento periodontal cultivadas (PDL) se demostró que la velocidad de fijación, crecimiento y metabolismo de estas células aumentó significativamente cuando estuvieron presentes EMD en los cultivos. También, las células expuestas a EMD mostraron mayor señalización por cAMP intracelular y producción autocrina de factores de crecimiento en comparación con los controles. Por otra parte las células epiteliales, aunque aumentaba la señalización por cAMP y secreción de factores de crecimiento cuando estaban presentes los EMD, fueron inhibidas tanto en la proliferación como en el crecimiento (Lyngstadaas et al., 2001, Journal of Clinical Periodontology 28, 181-188) .

En la literatura de patentes se ha descrito previamente que proteínas de la matriz del esmalte y derivados de la matriz del esmalte (EMD) son capaces de inducir la formación de tejido duro (por ejemplo, formación de esmalte, patente de US No. 4.672.032 (Slavkin) ) , apoyar la unión entre tejidos duros (EP-B-0 337 967 y EP-B-0 263 086) , favorecer la curación de heridas abiertas tales como de piel y mucosa, tener un efecto beneficioso en el tratamiento de enfermedades infecciosas e inflamatorias (EPO 1, 1059934 y EPO II, 01201915.4) , inducir la regeneración de la dentina (WO 01/97834) , facilitar la toma de un injerto (WO 00/53197) , inducir apoptosis en el tratamiento de neoplasmas (WO 00/53196) , y facilitar el relleno de una cavidad de herida y/o defecto tisular después de un procedimiento y/o trauma, tal como una cirugía citorreductora (WO 02/080994) .

Para la reparación o regeneración tisular, como se ejemplifica en las indicaciones médicas para EMD descritas anteriormente, las células deben migrar a un lecho de herida, proliferar, diferenciarse, y formar una configuración tisular final. Poblaciones de células múltiples deben participar frecuentemente en esta respuesta morfogenética.

Sin embargo, cualquiera de los efectos o usos descritos anteriormente de sustancias del esmalte activas, tales como la matriz del esmalte, derivados de la matriz del esmalte y/o proteínas de la matriz del esmalte, han sido documentados para formulaciones de sustancia del esmalte activas a concentraciones relativamente altas. Siendo una concentración típica entre 10-30 mg/ml.

Se ha demostrado que la baja concentración de EMP o amelogenina es eficaz en modelos in vitro, a 1 mg/ml, sin embargo todos los experimentos in vivo sobre pacientes reales se realizaron con dosificaciones que variaban desde 3 mg/ml a 30 mg/ml. (ver www.molnlycke.com/Files/XelmaResources/Full_report.pdf) .

Ningún efecto ha podido observarse hasta ahora con formulaciones de sustancia del esmalte activas a concentraciones inferiores. Sin desear limitar la presente invención a una teoría específica, esto es potencialmente debido al hecho de que todas las formulaciones farmacéuticas y/o cosméticas usadas hasta ahora se han destinado a liberar la sustancia del esmalte activa de una manera incontrolada.

Análogamente, para poder bajar la dosificación de factor de crecimiento de fibroblastos básico administrado, se diseñaron dispositivos de liberación controlada basados en el uso de heparina inmovilizada para secuestrar el factor de crecimiento. Por ejemplo, Edelman et al. (Biomaterials 1991 September; 12 (7) :619-26) usaron perlas de SEPHAROSETM conjugada con heparina dentro de alginato. Las perlas sirvieron como depósitos que liberaban factor de crecimiento de fibroblastos básico (“bFGF”) lentamente, basado en la unión y disociación de bFGF... [Seguir leyendo]

1. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica para administrar una sustancia del esmalte activa, que comprende una matriz polimérica y una sustancia del esmalte activa, que comprende al menos un fragmento de amelogenina, donde la concentración de dicha sustancia del esmalte activa es aproximadamente 1 mg/ml de formulación, o menos.

2. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 1, donde la concentración de la sustancia del esmalte activa es menor que 250 μg/ml. 10

3. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 2, donde la concentración de la sustancia del esmalte activa es menor que 100 μg/ml.

4. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 1, donde la concentración de la 15 sustancia del esmalte activa es menor que 50 μg/ml.

5. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 1, donde la concentración de la sustancia del esmalte activa es entre 1 μg/ml y 1 mg/ml.

6. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 1, donde la concentración de la sustancia del esmalte activa es entre 10 μg/ml y 250 μg/ml.

7. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 1, donde la concentración de la sustancia del esmalte activa es entre 100 μg/ml y 500 μg/ml. 25

8. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una matriz polimérica y una sustancia del esmalte unida a dicha matriz por un enlace covalente o no covalente.

9. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha matriz polimérica se forma por una reacción nucleofílica de adición entre un nucleófilo fuerte y un enlace insaturado conjugado, o un grupo insaturado conjugado.

10. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 35 precedentes, donde dicha matriz es adecuada para crecimiento interno o migración celular.

11. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha matriz es oclusiva de células.

12. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha matriz está preformada.

13. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha matriz se forma in situ. 45

14. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha sustancia del esmalte activa es amelogenina.

15. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones

50 precedentes, donde dicha sustancia del esmalte activa está enlazada a dicha matriz debido a una reacción nucleofílica de adición de al menos un residuo de cisteina a un grupo insaturado conjugado de al menos uno de los componentes de la matriz.

16. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicho al menos un 55 residuo de cisteína está situado en el C-terminal de dicha sustancia del esmalte activa.

17. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicho al menos un residuo de cisteína está situado en el N-terminal de dicha sustancia del esmalte activa.

60 18. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde dicha sustancia del esmalte activa está químicamente modificada.

19. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15-18, donde dicha cisteína está unida a dicha sustancia del esmalte activa por la vía de una secuencia enlazante. 65

20. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 19, donde dicha secuencia enlazante comprende una secuencia aminoacídica degradable enzimáticamnte.

21. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 19, donde dicho enlazante 5 comprende una secuencia para degradación proteolítica.

22. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 19, donde dicha secuencia es una secuencia degradable por plasmina.

23. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19-22, donde dicha secuencia enlazante incluye además una secuencia que es degradable por hidrólisis no específica.

24. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 23, donde dicha secuencia comprende un enlace éster. 15

25. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19-24, donde dicho enlazante comprende un sustrato para degradación polisacarídica.

26. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde

dicha sustancia del esmalte activa está incorporada a la matriz polimérica a través de un dominio sustrato de transglutaminasas.

27. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 26, donde dicho dominio de transglutaminasas es un dominio sustrato de Factor XIIIa. 25

28. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde dicha matriz polimérica se modifica a través de la inclusión de al menos una heparina y/o fragmento de unión a heparina.

29. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicha sustancia del esmalte activa está unida covalentemente o no covalentemente a dicha matriz polimérica a través de al menos un fragmento de unión a heparina.

30. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-29, donde 35 dicha matriz polimérica comprende poli (etilenglicol) .

31. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-29, donde dicha matriz polimérica comprende fibrina.

32. Una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para usar como un medicamento.

33. Uso de una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-31, para la fabricación de un medicamento para reparar tejido mineralizado tal como hueso, cartílago y dientes. 45

34. Uso de una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-31, para la fabricación de un medicamento para reparación tisular de tejido no mineralizado tal como tejido blando y mucosa.

50 35. Uso de una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-31, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que implica inflamación.

36. Uso de una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-31, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que implica infección. 55

37. Una composición farmacéutica y/o terapéutica que comprende una formulación farmacéutica y/o terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-32, que comprende además una composición farmacéutica y/o terapéutica que comprende 30 mg de proteína de la matriz del esmalte, y 1 ml de alginato de propilenglicol, siendo la relación en peso aproximadamente 80/8/12 entre los principales picos proteicos a 20, 14 y 5 kDa, respectivamente.

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7A Figura 7B Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13