La presente invención se relaciona con un disolvente que comprende un fluido supercrítico y un co-disolvente,

donde dicho co-disolvente comprende un alcohol de entre 1 a 4 átomos de carbono y un ácido orgánico, así como el uso de dicho disolvente en un procedimiento de extracción de lisofosfolípidos a partir de una mezcla de lípidos con un alto porcentaje de lípidos neutros.

Fluido supercrítico y su empleo en procedimientos de fraccionamiento supercrítico para la purificación de lisofosfolipidos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuadra dentro de los procedimientos de purificación de fosfolípidos, en particular de lisofosfolípidos, a partir de mezclas que comprenden mezclas de fosfolípidos y lípidos neutros, mediante el empleo de fluidos supercríticos.

ANTECEDENTES

Los lisofosfolipidos (LPLs) han atraído recientemente la atención debido al descubrimiento de su importante actividad biológica además de su ya conocido papel en el metabolismo de fosfolípidos. Los lisofosfolípidos están implicados en muchos procesos fisiológicos y patológicos como la inflamación, reproducción, angiogénesis, carcinogénesis, aterosclerosis y regulación del sistema nervioso (Moolenaar, W.H. Development of our current understanding of bioactive lysophospholipids, Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000, 905, 1–10) . La elucidación del mecanismo implicado en los papeles enzimáticos, biológicos, celulares y de membrana pasa por la disponibilidad de fuentes diversas de estos compuestos. Una amplia variedad de rutas químicas y enzimáticas han sido descritas en la literatura (Paola D’Arrigo and Stefano Servi. Synthesis of Lysophospholipids, Molecules 2010, 15, 1354-1377) . En la mayoría de los casos tras el proceso de síntesis se requiere una etapa de purificación que permita aislar el lisofosfolípido producido. Un método clásico para eliminar lípidos neutros de mezclas que contienen fosfolípidos es la precipitación con acetona (The Japan Chemical Society (ed.) , "Shin Jikken Kagaku Koza (A New Series of Lectures on Experimental Chemistr y ) 20, Seibutsu-Kagaku (Biochemistr y ) (I) ", pp. 418419, 1978) . Según este método los lípidos neutros son separados como compuestos solubles en acetona y los fosfolípidos quedan como compuestos insolubles. De este modo se encuentran disponibles lecitinas de 98 % de pureza en fosfolípidos. Sin embargo, este procedimiento en presencia de lisofosfolípidos, incluso repetido en varias ocasiones, no es capaz de reducir el contenido de lípidos neutros por debajo del 15 % (US 5, 153, 125) . Otros métodos implican el fraccionamiento con disolventes y su combinación con columnas cromatográficas. Todos estos métodos son muy laboriosos e implican la utilización de disolventes que reduce su aplicabilidad en el campo alimentario.

En los últimos años, se ha prestado mucha atención a los fluidos supercríticos para una amplia gama de aplicaciones en la búsqueda de disolventes más respetuosos con el medio ambiente (Supercritical Fluid Extraction of Nutraceuticals and Bioactive Compounds. Ed. José L. Martínez. CRC Press. 2008) . Entre estas aplicaciones, es posible citar la separación de lípidos neutros de fosfolípidos. No obstante, diversos estudios indican que, conforme aumenta el contenido en fosfolípidos, la extracción de lípidos neutros es cada vez más difícil. La situación resulta aún más compleja en presencia de lisofosfolípidos ya que se ha descrito que éstos pueden llegar a formar complejos iónicos con los ácidos grasos libres (Nisar A. Shaikh., Assesment of various techniques for the quantitative extraction of lysophospholipids from myocardial tissues, Anal. Biochem. 216 (2) :313-21, 1994) .

Se ha observado que la adición de pequeños porcentajes de etanol al fluido supercrítico mejora sin embargo la extracción de los lípidos neutros en presencia de fosfolípidos (WO2007/123424 y Catchpole, O.J. et al., The extraction and fractionation of specialty lipids using near critical fluids, J. of Supercritical Fluids 2009, 47, 591– 597) . Sin embargo, dicha extracción no contempla la presencia de lisofosfolípidos en la mezcla cuya mayor polaridad, como se ha mencionado anteriormente, dificulta notablemente su purificación.

Por todo ello, se hace necesario el desarrollo de un procedimiento que permite la extracción de lisofosfolípidos a partir de mezclas con lípidos neutros, con al menos el mismo grado de pureza que el que se consigue con otras técnicas convencionales, pero minimizando el uso de disolventes orgánicos que permitan un uso más seguro del producto final.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han encontrado que el empleo de un fluido supercrítico que contiene una disolución alcohólica de un ácido orgánico permite, no sólo una eficaz extracción de los lisofosfolípidos, sino reducir considerablemente el empleo de disolventes orgánicos con respecto a técnicas tradicionales del estado de la técnica como la precipitación en acetona o el fraccionamiento combinado con columnas cromatográficas citadas anteriormente.

Además, la presencia de un ácido orgánico en la disolución alcohólica adicionada al fluido supercrítico permite mejorar la separación entre los lisofosfolípidos y los lípidos neutros. Así, los ejemplos aportados en la presente solicitud han demostrado que, tras el procedimiento de extracción utilizando dicha mezcla de fluido supercrítico y solución alcohólica de ácido orgánico, se consiguen extraer lisofosfolípidos con un mayor grado de pureza que

cuando dicho ácido orgánico está ausente, incluso partiendo de mezclas en las cuales el porcentaje de fosfolípidos que comprenden los lisofosfolípidos es menor con respecto al contenido de lípidos neutros. Así, en un primer aspecto la presente invención se dirige a un disolvente que comprende:

- un fluido supercrítico; y

- un co-disolvente que comprende un alcohol de entre 1 a 4 átomos de carbono y un ácido orgánico. En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento (de aquí en adelante Procedimiento 1) para la separación de lisofosfolípidos a partir de una mezcla de lípidos que comprende:

a) proporcionar una mezcla de lípidos que comprende lisofosfolípidos, fosfolípidos y lípidos neutros;

b) proporcionar un disolvente que comprende:

- un fluido supercrítico; y

- un co-disolvente que comprende un alcohol de entre 1 a 4 átomos de carbono y un ácido

orgánico;

c) poner en contacto la mezcla de lípidos y el disolvente;

d) separar el disolvente que contiene los componentes solubles de los componentes insolubles. En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento (de aquí en adelante Procedimiento 2) para la separación de lisofosfolípidos a partir de una mezcla de lípidos que comprende: a) proporcionar una mezcla de lípidos que comprende lisofosfolípidos, fosfolípidos y lípidos neutros; b) proporcionar una disolución alcohólica que comprende un alcohol de entre 1 a 4 átomos de carbono y un ácido orgánico; c) adicionar la disolución alcohólica sobre la mezcla de lípidos; d) poner en contacto el producto obtenido tras la etapa c) con un fluido supercrítico; e) separar el disolvente que contiene los componentes solubles de los componentes insolubles.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El disolvente objeto de la presente invención comprende un fluido supercrítico y un co-disolvente, donde dicho co-disolvente comprende un alcohol de entre 1 a 4 átomos de carbono y un ácido orgánico.

Por fluido supercrítico se entiende cualquier sustancia que se encuentre en condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico. Por encima, pero próximo a dicho punto, la sustancia se encuentra en estado fluido pero comparte las propiedades de un líquido y un gas. Así, el fluido tiene una densidad similar a la de un líquido, mientras que su viscosidad y difusividad son similares a las de un gas.

En una realización particular, el fluido supercrítico es CO2 supercrítico.

Por su parte, el alcohol es un alcohol de entre 1 a 4 átomos de carbono, tal como metanol, etanol, propanol, isopropanol, n-butanol o tert-butanol. En una realización preferente, el alcohol es etanol. Como ácido orgánico se puede emplear cualquiera que permita su disolución en la solución alcohólica. En

particular, se prefiere el uso de un ácido orgánico de entre 1 a 6 átomos de carbono tal como por ejemplo ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido láctico o ácido cítrico. En una realización aún más preferente, el ácido orgánico es ácido fórmico.

El co-disolvente supone, por tanto, una disolución alcohólica... [Seguir leyendo]

1. Un disolvente que comprende: -un fluido supercrítico; y -un co-disolvente que comprende un alcohol de entre 1 a 4 átomos de carbono y un ácido orgánico.

2. Disolvente según la reivindicación 1, donde el fluido supercrítico es CO2 supercrítico.

3. Disolvente según reivindicaciones 1 ó 2, donde el alcohol es etanol.

4. Disolvente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el ácido orgánico tiene de 1 a 6 átomos de carbono.

5. Disolvente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el ácido orgánico es ácido fórmico.

6. Disolvente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la proporción de co-disolvente que se adiciona al fluido supercrítico se encuentra entre el 1 y 10% en peso con respecto al peso del fluido supercrítico.

7. Disolvente según reivindicación 6, donde la proporción de co-disolvente que se adiciona al fluido supercrítico se encuentra entre el 2 y 5% en peso con respecto al peso del fluido supercrítico.

8. Disolvente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la proporción de ácido orgánico en el codisolvente está comprendida entre el 1 y 20% en volumen con respecto al volumen total del co-disolvente.

9. Disolvente según reivindicación 8, donde la proporción de ácido orgánico en el co-disolvente está comprendida entre el 5 y 15% en volumen con respecto al volumen total del co-disolvente.

10. Disolvente según reivindicación 1, donde el fluido supercrítico es CO2 supercrítico, el alcohol es etanol y la proporción del co-disolvente está comprendida entre el 1 y el 10% en peso con respecto al peso del CO2.

11. Un procedimiento para la separación de lisofosfolípidos a partir de una mezcla de lípidos que comprende: a) proporcionar una mezcla de lípidos que comprende lisofosfolípidos, fosfolípidos y lípidos neutros; b) proporcionar un disolvente que comprende:

- un fluido supercrítico; y -un co-disolvente que comprende un alcohol de entre 1 a 4 átomos de carbono y un ácido

orgánico; c) poner en contacto la mezcla de lípidos y el disolvente; y d) separar el disolvente que contiene los componentes solubles de los componentes insolubles.

12. Procedimiento según reivindicación 11, donde el fluido supercrítico es CO2 supercrítico.

13. Procedimiento según reivindicaciones 11 ó 12, donde el co-disolvente es una disolución etanólica de un ácido orgánico.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde la temperatura a la que se efectúa el contacto entre la mezcla de lípidos y el disolvente oscila entre 35 y 65ºC.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, donde la presión a la que se efectúa el contacto entre la mezcla de lípidos y el disolvente oscila entre 100 y 350 bares.

16. Un procedimiento para la separación de lisofosfolípidos a partir de una mezcla de lípidos que comprende: a) proporcionar una mezcla de lípidos que comprende lisofosfolípidos, fosfolípidos y lípidos neutros; b) proporcionar una disolución alcohólica que comprende un alcohol de entre 1 a 4 átomos de

carbono y un ácido orgánico; c) adicionar la disolución alcohólica sobre la mezcla de lípidos; d) poner en contacto el producto obtenido tras la etapa c) con un fluido supercrítico; e) separar el disolvente que contiene los componentes solubles de los componentes insolubles.

17. Procedimiento según reivindicación 16, donde el alcohol es etanol.

18. Procedimiento según reivindicaciones 16 ó 17, donde el ácido orgánico es ácido fórmico.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde la proporción de ácido orgánico en la disolución alcohólica está comprendida entre el 1 y 20% en volumen con respecto al volumen total de dicha disolución.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde el fluido supercrítico es CO2 supercrítico.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, donde la temperatura a la que se efectúa el contacto entre el producto obtenido tras la etapa c) del procedimiento y el fluido supercrítico oscila entre 35 y 65ºC.

22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, donde la presión a la que se efectúa el contacto entre el producto obtenido tras la etapa c) del procedimiento y el fluido supercrítico oscila entre 100 y 350 bares.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 22, donde la mezcla de lípidos se encuentra en forma sólida.

24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 23, donde los lípidos neutros se seleccionan entre ácidos grasos, ésteres de los mismos, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos y mezclas de los mismos.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 24, donde la mezcla de lípidos contiene entre 30% y 60% en peso de fosfolípidos, de los cuales entre el 1 y el 99% en peso son lisofosfolípidos, y entre 40% y 70% de ácidos grasos libres.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 25, donde la mezcla de lípidos contiene entre 30% y 60% en peso de fosfolípidos, de los cuales más del 90% en peso son lisofosfolípidos, y entre 40% y 70% de ácidos grasos libres

27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 26, donde el fosfolípido es fosfatidilcolina y el lisofosfolípido es lisofosfatidilcolina.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 27, donde la separación del disolvente que contiene los componentes solubles de los componentes insolubles se realiza mediante despresurización en cascada.