Método para preparar un virus objetivo no adenoviral o una o más proteínas objetivo que no estén relacionadas con el adenovirus,

comprendiendo dicho método:

(a) cultivar una célula inmortalizada de expresión de vertebrado, que puede obtenerse infectando o transfectando una célula huésped inmortalizada de vertebrado, con dicho virus objetivo, con un vector portador de secuencias de ácido nucleico que codifican dicho virus, o con un vector portador de secuencias de ácido nucleico que codifican dichas una o más proteínas objetivo, en el que dicha célula inmortalizada de expresión de vertebrado presenta integrado en su genoma de manera estable un gen que codifica la PIX de adenovirus y que expresa de manera estable dicha PIX de adenovirus; y

(b) aislar dicho virus objetivo no adenoviral o dichas una o más proteínas objetivo.

Factor proteico que aumenta la productividad, nuevas líneas celulares y sus usos.

La presente invención proporciona un método para preparar un virus objetivo no adenoviral o proteínas objetivo utilizando una línea celular de expresión potente que presenta integrado de manera estable en su genoma un gen que codifique una proteína PIX.

Antecedentes de la invención

Los productos biofarmacéuticos de las células eucarióticas son parte integrante de la medicina moderna. No obstante, el incremento de la productividad y de la seguridad son parámetros importantes que aún siguen requiriendo una importante optimización. El obstáculo más fundamental en los esfuerzos orientados hacia la optimización es el sustrato celular en sí mismo. Un transgén que pueda introducirse en las líneas celulares ya liberado para su uso en procesos biofarmacéuticos para incrementar los rendimientos de productos a partir de dichas células manipuladas resulta extremadamente valioso.

Los adenovirus son virus no envueltos (desnudos) con ADN de doble cadena, que infectan un amplio espectro de animales. Entre los miembros mejor caracterizados se encuentra el serotipo 5 del adenovirus humano (Ad5) . El virus es una causa frecuente de los síntomas del resfriado común, y la infección suele producirse en la infancia.

Los adenovirus son susceptibles de ser sometidos a manipulación genética, y los adenovirus incompetentes para replicación, incluyendo el Ad5 (número de orden GenBank para la secuencia: AC_000008) se utilizan como vectores en la terapia génica y para la vacunación terapéutica. Con el fin de obtener virus incompetentes para la replicación, amplias regiones del ADN genómico son sustituidas por secuencias no virales. Las funciones virales ausentes serán suministradas en trans mediante líneas de células huésped transfectadas de forma estable con genes que se hayan eliminado del vector. Uno de los sistemas anteriores que se desarrollaron consta de vectores adenovirales suprimidos en la región reguladora E1 producidos en las líneas celulares, con el suministro de las proteínas E1 correspondientes.

La línea celular más común para este propósito es la línea celular 293. Esta línea se generó en 1977 mediante transfección de ADN genómico adenoviral fragmentado en células primarias humanas (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59-74 (1977) ) , bastante antes de que se reconociera que los adenovirus podían servir como vectores de la terapia génica. Posteriormente, se observó que la línea celular resultante contenía los nucleótidos 1 a 4344 del ADN genómico (Louis et al., Virology 233, 423-429 (1997) ) , que incluye la región E1; esta caracterización puso de manifiesto que la región E1 puede utilizarse para inmortalizar y transformar células primarias.

Junto a la región E1 se encuentra el gen de pIX ("proteína 9", nucleótidos 3609 a 4031 en el ADN genómico) . El promotor de pIX está alojado en el componente E1B de la región E1. Un mecanismo, denominado oclusión del promotor, permite la expresión de pIX en un momento posterior-anterior en el ciclo de infección viral, en el momento de la aparición de la replicación del ADN viral con un número creciente de ADN viral (Fessler y Young, J. Virol. 72, 4049-4056 (1998) ) . Aunque el gen esté presente en los 4344 nucleótidos integrados en 293 células, la expresión pIX no puede detectarse ni siquiera con métodos sensibles de etiquetado radiactivo (Spector et al., J. Virol. 36, 860-871 (1980) ) .

Tal y como se ha descrito anteriormente, se han generado vectores adenovirales deficientes de replicación mediante la eliminación de la región E1 del genoma viral. Los productos E1 son fundamentales para la replicación viral y, por tanto, la función de la región E1 tiene que proporcionarse en trans a través de transgenes E1 estables en la célula empaquetadora del adenovirus (como la línea celular 293) . Debido a la proximidad con la región E1, el gen pIX provocaba una recombinación frecuente entre los vectores adenovirales suprimidos y la región E1 en el genoma huésped. Este episodio de recombinación generaba adenovirus competentes para la replicación (RCA) , una importante contaminación en las preparaciones del vector. Para suprimir esta posibilidad de recombinación, el pIX fue eliminado del genoma del adenovirus. Durante el transcurso de estos experimentos, se reconoció que el pIX estabiliza el cápside del adenovirus con respecto a la tensión térmica y estérica incrementando la interacción de los principales elementos constituyentes, los hexones (Colby y Shenk, J. Virol. 39, 977-980 (1981) ; Ghosh-Choudhur y etal., EMBOJ.6, 1733-1739 (1987) ) . Morfogénesis en ausencia de virus sensibles a la temperatura con rendimientos pIX que no pueden suministrar moléculas de ADN genómico más grandes que el 105% de los 35938 pares de bases de tipo salvaje. Para seguir permitiendo una capacidad de empaquetado normal y una estabilidad térmica, la proteína pIX se introdujo de forma estable o episomal en las líneas celulares, previstas como células empaquetadoras para vectores de adenovirus (Krougllakand Graham, Hum. Gene Ther. 6, 1575-1586 (1995) ; Carovokyri, C. and Leppard, K.N., J.Virol. 69, 6627-6633 (1995) WO 99/57296 e Imleret al., Gene Therapy 3, 75-84 (1996) ) .

Asimismo, con el reconocimiento de que el pIX decora la superficie de los viriones, se han generado proteínas de fusión pIX para ampliar la gama huésped de vectores de adenovirus o de seguir a la morfogénesis y a la migración intracelular de partículas de virus (revisado por Parks, Mol. Ther. 11, 19-25 (2005) ) .

Aunque es claramente una proteína estructural, la pIX también tiene implicaciones como proteína reguladora para la replicación de adenovirus. Se parte de la base de que la PIX funciona como un transactivador de la transcripción para aumentar la expresión E1A, una función posiblemente ejercida incluso como viroquinas por la proteína PIX entrante procedente del cápside en la fase de infección (revisado por Parks, Mol. Ther. 11, 19-25 (2005) ) . La PIX, junto con la proteína anterior E4 Orf3, también se describe como elemento de interacción con inclusiones subnucleares, denominados cuerpos PNL (Puvion-Dutilleul et al., Exp. Cell. Res. 218, 9-16 (1995) ; Leppard y Everett, J. Gen. Virol. 80, 997-1008 (1999) ) . Estos son conjuntos dinámicos de entre 250 nm y 500 nm de tamaño, que se pretende que estén implicados en la regulación de la diferenciación celular (Wang et al., Science 279, 1547-1551 (1998) ) , en el control de la apoptosis (Quignon et al., Nature Gen. 20, 259-265 (1998) ) y en la respuesta a la infección viral (Moller y Schmitz, Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 51, 295-300 (2003) ) .

Debido a sus efectos pleotrópicos, se introdujo la proteína PIX en líneas celulares para examinar si ésta aumenta la proliferación celular o las propiedades de producción de productos biofarmacéuticos que no están relacionados con adenovirus ni con vectores adenovirales. Existe una necesidad general de factores que modulen estas propiedades en las líneas celulares establecidas.

Por ejemplo, los virus atenuados (debilitados) son unos candidatos prometedores en lo que a vacunas se refiere: en el momento de su inoculación, imitan una infección natural, pero proporcionan más tiempo para que el sujeto vacunado pueda desarrollar la respuesta inmune de protección deseada. Con un número creciente de pacientes inmunocomprometidos (por ejemplo, debido a la infección por el VIH) , es deseable contar con cepas altamente atenuadas. Mientras que las cepas atenuadas aún siguen su camino hacia provocar la infección (normalmente benigna) , las cepas altamente atenuadas son bloqueadas a nivel celular incluso en ausencia de un sistema inmune funcional. Un método utilizado con frecuencia para establecer y mantener la atenuación es hacer que los virus pasen a diferentes tejidos huésped. Por ejemplo, los virus del sarampión y de las paperas destinados a la vacunación humana pasan a células primarias, ya sea en huevos con embriones de pollo o en cultivos derivados de éstos. Una nueva generación de vacunas está basada en poxvirus altamente atenuados que también dependen de las células primarias de pollo para su producción. Por tanto, una línea celular que pueda reemplazar las células primarias de pollo y que, al mismo tiempo, pueda protegerse a sí misma (incluso con menor eficacia) frente a una infección viral provocada por manipulaciones secundarias, como la introducción del transgén PIX, proporciona un sustrato altamente deseable.

Para otros propósitos, puede resultar preferida una línea celular... [Seguir leyendo]

1. Método para preparar un virus objetivo no adenoviral o una o más proteínas objetivo que no estén relacionadas con el adenovirus, comprendiendo dicho método:

(a) cultivar una célula inmortalizada de expresión de vertebrado, que puede obtenerse infectando o transfectando una célula huésped inmortalizada de vertebrado, con dicho virus objetivo, con un vector portador de secuencias de ácido nucleico que codifican dicho virus, o con un vector portador de secuencias de ácido nucleico que codifican dichas una o más proteínas objetivo, en el que dicha célula inmortalizada de expresión de vertebrado presenta integrado en su genoma de manera estable un gen que codifica la PIX de adenovirus y que expresa de manera estable dicha PIX de adenovirus; y

(b) aislar dicho virus objetivo no adenoviral o dichas una o más proteínas objetivo.

2. Método según la reivindicación 1, en el que:

(i) la PIX de adenovirus se modifica mediante fusión con un factor de transcripción, una proteína marcadora de fluorescencia, una enzima, o un péptido de tránsito; y/o

(ii) la PIX de adenovirus se expresa en la célula huésped y la célula de expresión en una cantidad de por lo menos 1 pg/!g de proteína celular; y/o

(iii) el gen que codifica la PIX de adenovirus está bajo el control de un promotor heterólogo u homólogo estable.

3. Método según la reivindicación 2, en el que:

(i) dicho factor de transcripción es el receptor de ácido retinoico alfa, dicha proteína marcadora de fluorescencia es la GFP o DsRed, dicha enzima es LacZ o dicho péptido de tránsito es un NLS; y/o

(ii) el mencionado promotor es un promotor celular constitutivo.

4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que la PIX de adenovirus:

(i) presenta la secuencia como se representa en la SEC ID nº : 2;

(ii) está fusionada con el receptor de ácido retinoico alfa (RARA) ;

(iii) está fusionada con la GFP y una secuencia NLS;

(iv) está fusionada con la GFP; o

(v) está fusionada con una secuencia NLS aislada.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la PIX de adenovirus fusionada con el receptor de ácido retinoico alfa presenta la secuencia tal y como se representa en la SEC ID nº : 4, o en el que la PIX de adenovirus fusionada con la GFP y una secuencia NLS presenta la secuencia tal como se representa en la SEC ID nº : 23.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que:

(i) la célula huésped y de expresión es portadora de genes (virales) inmortalizadores adicionales, incluyendo una proteína E1 de un adenovirus; y/o

(ii) la célula es portadora, además, de secuencias funcionales tales como secuencias de marcador de selección, sitios donadores/aceptores de empalme y/o secuencias de reconocimiento de recombinasa, que permiten la integración de una secuencia de ácido nucleico objetivo para ser expresada en la célula.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que:

(i) el virus objetivo es seleccionado de entre virus de tipo salvaje, mutado o eliminado, virus adaptado al frío o atenuado, cepa de vacuna y un vector viral; o

(ii) la proteína o proteínas objetivo son seleccionadas a partir de anticuerpos, proteínas recombinantes, antígenos virales u hormonas peptídicas.

8. Método según la reivindicación 7, en el que el vector viral se selecciona de entre un lentivirus, un poxvirus, un virus adenoasociado (aav) , un herpesvirus o un flavivirus.

9 Método según la reivindicación 8, en el que el poxvirus se selecciona de entre un virus de la viruela bovina (cowpox) , un virus de la viruela aviar (fowlpox) y un virus de la viruela del canario (canar y pox) .

10. Método según la reivindicación 9, en el que el virus de la viruela bovina es un virus vaccinia modificado de Ankara (MVA) .

11. Método según la reivindicación 7, en el que:

(i) las proteínas recombinantes se seleccionan de entre eritropoyetina, alfa-1-antitripsina, factores VIII y IX de coagulación de la sangre, e interferones; o

(ii) los antígenos virales se seleccionan de entre HA o NA de la gripe, HBV-S, proteína G del herpes o proteína G de la rabia.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la célula huésped y de expresión se obtiene a partir del cerebro humano.

13. Método según la reivindicación 12, en el que la célula huésped y de expresión se obtiene a partir del cerebro fetal humano.

14. Método según la reivindicación 13, en el que la célula huésped es una célula NC5T11#34 y la célula de expresión se obtiene a partir de la célula NCST11#34, estando dicha célula NCST11#34 depositada en el DSMZ con el número de registro DSM ACC2744.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la célula huésped y de expresión es una célula de ave.

16. Método según la reivindicación 15, en el que la célula huésped y de expresión es una célula de ave obtenida a partir de la retina de pato o de somitas de pato.

17. Método según la reivindicación 16, en el que la célula huésped es una célula CR.PIX (17a11b) , y la célula de expresión se obtiene a partir de la célula CR.PIX (17a11b) , estando dicho célula CR.PIX (17a11b) depositada en el DSMZ con el número de registro DSM ACC2749.

18. Célula inmortalizada de expresión de un vertebrado para producir un virus objetivo no adenoviral, que:

(i) presenta integrado de manera estable en su genoma un gen que codifica la PIX de adenovirus y expresa de manera estable dicha PIX de adenovirus; y

(ii) está infectada o transfectada con un virus objetivo no adenoviral o con un vector portador de secuencias de ácido nucleico que codifican dicho virus.

19. Célula inmortalizada de expresión de un vertebrado según la reivindicación 18, en la que:

(i) la PIX de adenovirus se modifica mediante fusión con un factor de transcripción, una proteína de marcador de fluorescencia, una enzima o un péptido de tránsito; y/o

(ii) la PIX de adenovirus se expresa en la célula huésped y la célula de expresión en una cantidad de por lo menos 1 pg/!g de proteína celular; y/o

(iii) el gen que codifica la PIX de adenovirus está bajo el control de un promotor heterólogo u homólogo estable.

20. Célula inmortalizada de expresión de un vertebrado según la reivindicación 19, en la que:

(i) dicho factor de transcripción es el receptor de ácido retinoico alfa, dicha proteína marcadora de fluorescencia es la GFP o DsRed, dicha enzima es LacZ o dicho péptido de tránsito es un NLS; y/o

(ii) dicho promotor es un promotor celular constitutivo.

21. Célula inmortalizada de expresión de un vertebrado según las reivindicaciones 18 a 20, en la que el vector viral se selecciona de entre un lentivirus, un poxvirus, un virus adenoasociado (aav) , un herpesvirus y un flavivirus.

22. Célula inmortalizada de expresión de un vertebrado según la reivindicación 18, en la que la célula de expresión es obtenida a partir del cerebro humano.

23. Uso de la célula inmortalizada de expresión de un vertebrado según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 para preparar un virus objetivo no adenoviral.