EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN E. COLI.

Plásmido de ADN autorreplicante para expresión recombinante de una proteína marcada en el extremo N-terminal en una célula huésped microbiana comprendiendo una marca de ADN con una secuencia de nucleótidos que codifica una marca peptídica de la fórmula MKMK,

MKTK o MKSK, donde dicho ADN es operativamente enlazado a una secuencia del promotor.

Expresión de proteínas en E.coli Antecedentes de la invención [0001] Sistemas de expresión de proteína recombinante facilitan la producción de proteína, polipéptidos y péptidos para selección en el descubrimiento de medicamento y para una gama amplia de de aplicaciones incluyendo la producción de vacunas. Sistemas de expresión bacterianos han sido el método principal de elección, en gran medida debido a la facilidad de clonación de genes en bacterias, aunque levadura y baculovirus proporcionan sistemas de expresión alternativos fiables.

A pesar del uso amplio de sistemas de expresión recombinantes para la producción de proteínas, no se puede confiar en que los métodos disponibles produzcan cualquier proteína dada en rendimientos suficientes y teniendo homogeneidad suficiente para cumplir los requisitos siguientes. Rendimiento de proteína puede ser un problema mayor asociado a la sobreexpresión de proteínas en bacterias, donde la proteína es directamente tóxica para la célula huésped, o donde su acumulación trastoca el metabolismo o crecimiento de célula huésped. Proteínas grandes, al igual que proteínas con una estructura secundaria y terciaria compleja, tienden a ser insolubles y acumularse en cuerpos de inclusión en la célula huésped, donde generalmente son mejor toleradas por el huésped. No obstante, proteínas más pequeñas tienden a ser solubles y su acumulación puede ser tóxica. Varios sistemas de vectores se diseñan para expresar la proteína recombinante objetivo como una proteína de fusión con una marca peptídica N-terminal corta o más largo. Tales marcas, como las marcas de unión a histidina o maltosa, son particularmente útiles para la purificación subsiguiente de las proteínas recombinantes. Permanece, sin embargo, una necesidad de un sistema de expresión eficiente, especialmente paraproteínas terapéuticas que son potencialmente tóxicas y difíciles de expresar.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un plásmido de ADN autorreplicante para expresión recombinante de una proteína marcada N-terminalmente en una célula huésped microbiana comprendiendo una marca de ADN con una secuencia de nucleótidos que codifica una marca peptídica de la fórmula MKMK, MKTK o MKSK, donde dicho ADN es operativamente enlazado a una secuencia del promotor.

La invención además proporciona un plásmido de ADN autorreplicante para expresión recombinante de una proteína marcada en el extremo N-terminal en una célula huésped microbiana comprendiendo una marca de ADN, donde dicha marca de ADN codifica al menos cuatro residuos de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 15.

En una forma de realización, el plásmido de la invención comprendiendo además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína fundida en marco interno con dicha marca de ADN para expresión recombinante de una proteína marcada en el extremo N-terminal codificada por dicho ácido nucleico fundido a dicha marca de ADN.

En otra forma de realización, el plásmido de la invención tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 5.

En otra forma de realización, el plásmido de la invención tiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID nº : 4.

La invención además proporciona una célula huésped microbiana comprendiendo el plásmido según la invención.

En una forma de realización, la célula huésped microbiana según la invención, es E. coli.

La invención además proporciona una proteína marcada comprendiendo una marca de péptido N-terminal fundida a una proteína, donde dicha marca tiene al menos cuatro residuos de aminoácidos que consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionado de entre SEC ID NOs: 14, 15 y 16.

En una forma de realización, la proteína marcada de la invención tiene al menos cuatro residuos de aminoácidos que consisten en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NOs: 15.

En una forma de realización, la proteína marcada de la invención tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 5.

La invención además proporciona un método para expresión recombinante de una proteína marcada en el extremo N-terminal en una célula huésped microbiana que incluye las etapas de construcción de un plásmido recombinante comprendiendo inserción de una secuencia de ADN que codifica una proteína dentro del marco interno y 3' a la marca de ADN del plásmido según la presente invención, e introducción de dicho plásmido recombinante en una célula huésped microbiana, e inducción de expresión de dicha proteína marcada en el extremo N-terminal en una célula huésped microbiana.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Gel de SDS-poliacrilamida, manchado con azul de Coomassie que muestra fracciones de columna SP de sefarosa probadas durante purificación de MKHK-hIL-21 expresado de forma recombinante: sendero 1; marcadores de peso molecular de proteína; senderos 2-10 son fracciones a partir de la columna SP de sefarosa. Figura 2: la eficiencia y finalización de eliminación de marca para producir hIL-21 maduro fue determinada por espectrometría de masas, como se muestra en Figura 2, A y B.

Panel A muestra el espectro Maldi de fracciones antes de la eliminación de marca Panel B muestra las mismas fracciones después de la eliminación de marca.

ABREVIATURAS: [0015] Aminoácido: alanina (A) ; arginina (R) ; asparagina (N) ; ácido aspártico (D) ; cisteína (C) ; glicina (G) ; glutamina (q) ; ácido glutámico (E) ; histidina (H) ; isoleucina (I) ; leucina (L) ; lisina (K) ; metionina (m) ; fenilalanina (F) ; prolina (P) ; serina (S) ; treonina (T) ; triptófano (W) , tirosina (Y) ; valina (V) . C-terminal: carboxi (parte C) -terminal de una proteína, comprendiendo uno o más residuos de aminoácidos. HlL-21: humano interleuquina-21 N-terminal: amino (N) -terminal parte de una proteína, comprendiendo uno o más residuos de aminoácidos. SDS página: dodecilo de sodio (lauril) gel de sulfato-poliacrilamida Descripción de la invención [0016] La presente invención proporciona una marca de ADN, un vector de expresión o plásmido adecuado para la expresión recombinante de una proteína heteróloga, y un método para expresión de proteína recombinante, que es compatible con la purificación posterior de la proteína recombinante, y tratamiento eventual de la proteína recombinante para recuperación de la proteína en su forma nativa y activa.

Como se utiliza en este caso, el término "DNA tag" (marca de ADN) se define como una molécula de ADN que codifica una marca de proteína N-terminal que se añade a una codificación de secuencia de ADN para una proteína heteróloga, y que en la expresión en marco en un microorganismo produce una proteína contraseñada o proteína de fusión. La marca de ADN puede codificar al menos cuatro aminoácidos con una secuencia de aminoácidos definido por fórmula I.

En una forma de realización, n es 1.

En una forma de realización, X1 representa H o K.

En una forma de realización, X2 representa A, H, M, S o T.

Una marca de ADN puede codificar una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de la lista dada en la tabla 1, con una SEC ID Nos: 6-16. Como ilustrado en ejemplo 1, la expresión de una secuencia de ADN comprendiendo una marca de ADN, fundida dentro del marco interno a la secuencia codificante de una proteína, facilita niveles significativamente más altos de expresión de la proteína que una secuencia de control que codifica la proteína fundida a una metionina N-terminal. La marca de ADN puede codificar una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre MHAH, MHHA, MHHV, MKHK, MKMK, MKSK, y MKTK, con respectivamente SEC ID Nos: 7, 8, 10, 11, 14, 15 y 16. La marca de ADN puede codificar la secuencia de aminoácidos MKSK [SEC ID nº : 15]. No deseando quedar atados por la teoría, se cree que la expresión de proteína recombinante en una célula huésped microbiana, en particular una célula E.coli, es mejorada si la proteína expresada se acumula en una forma que no sea tóxica a metabolismo de célula huésped o crecimiento, por ejemplo en un cuerpo de inclusión. Así las marcas de proteína N-terminal seleccionadas fundidas a proteínas recombinantes pueden mejorar su expresión por facilitar su acumulación en cuerpos de inclusión.

Muchas proteínas mamíferas de interés se segregan en su huésped natural... [Seguir leyendo]

1. Plásmido de ADN autorreplicante para expresión recombinante de una proteína marcada en el extremo N-terminal en una célula huésped microbiana comprendiendo una marca de ADN con una secuencia de nucleótidos que codifica una marca peptídica de la fórmula MKMK, MKTK o MKSK, donde dicho ADN es operativamente enlazado a una secuencia del promotor.

2. Plásmido de ADN autorreplicante para expresión recombinante de una proteína marcada en el extremo N-terminal en una célula huésped microbiana comprendiendo una marca de ADN, donde dicha marca de ADN codifica al menos cuatro residuos de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº . 15.

3. Plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, comprendiendo además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína fundida dentro del marco de lectura con dicha marca de ADN para expresión recombinante de una proteína marcada N-terminal codificada por dicho ácido nucleico fundido a dicha marca de ADN.

4. Plásmido según la reivindicación 3, donde dicha proteína tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 5.

5. Plásmido según la reivindicación 3 o 4, donde dicha secuencia de ácidos nucléicos codificando una proteína consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID nº : 4.

6. Célula huésped microbiana comprendiendo el plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5,

7. Célula huésped microbiana según la reivindicación 6, donde dicha célula es E. coli.

8. Proteína marcada comprendiendo una marca peptídica N-terminal fundida a una proteína, donde dicha marca tiene al menos cuatro residuos de aminoácidos que consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID NOs: 14, 15 y 16.

9. Proteína marcada según la reivindicación 9, donde dicha marca peptídica tiene al menos cuatro residuos de aminoácidos que consisten en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NOs: 15.

10. Proteína marcada según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, donde dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 5.

11. Método para expresión recombinante de una proteína marcada en el extremo N-terminal en una célula huésped microbiana comprendiendo las etapas de:

a. construcción de un plásmido recombinante comprendiendo inserción de una secuencia de ADN que codifica una proteína dentro del marco de lectura y 3' a la marca de ADN del plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, e

b. introducción de dicho plásmido recombinante en una célula huésped microbiana, e

c. inducción de expresión de dicha proteína marcada en el extremo N-terminal en una célula huésped microbiana.

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